3种植物花螺原体的分离及其基本特性-生物谷-生物医药门户VIP免费

ISSN0001-6209;CN11-1995/Qhttp://journals.im.ac.cn3种植物花螺原体的分离及其基本特性于汉寿，阮康勤，纪燕玲，陈永萱，王志伟(南京农业大学农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，南京210095)摘要：【目的】调查我国植物花上的螺原体的存在，搜集我国的螺原体资源，并研究它们的基本生物学特性。【方法】常规螺原体分离、培养方法，应用暗视野显微镜和透射电子显微镜观察螺原体形态，根据16SrDNA和ITS序列构建系统发育树研究螺原体分离菌株可能的分类地位。【结果】分别从油菜(Brassicanapus)、杜鹃(Rhododendronsimsii)、红花酢浆草(Oxaliscorymbosa)3种植物花表分离到4株螺原体CNR-1和CNR-2、CNA-1、CRW-1，对其形态、部分生理生化特性及分子生物学特性进行了初步研究。这4株螺原体在R-2液体培养基中生长良好，都能通过孔径为0.22m的微孔滤膜；在R-2固体培养基上呈圆形或颗粒状菌落，菌落直径约50~600m；在生长的某个阶段可呈典型的螺旋状，菌体直径为37.04~370.40nm，长度约0.89~11.88m；它们都能利用葡萄糖作为碳源，不能利用尿素；在不含胎牛血清的R-2培养基中，它们都不能生长；菌株CNR-1、CNA-1能强烈代谢精氨酸，而CNR-2和CRW-1不能代谢精氨酸；在氨苄青霉素钠浓度高达2000U/mL的R-2培养基中，分离菌株生长良好。根据16SrDNA序列构建的系统发育树显示，分离菌株CNR-1和CNR-2、CNA-1与蜜蜂螺原体Spiroplasmamelliferum聚类较近，而CRW-1与S.clarkii聚类较近；根据ITS序列构建的系统发育树显示，CRW-1形成一个单独的分枝，其它3个菌株仍与S.melliferum聚类。【结论】以上结果初步表明，分离菌株CNR-1和CNR-2、CNA-1极有可能是Spiroplasmamelliferum，而CRW-1可能是一个新的螺原体种，但还需要血清学试验进一步验证。关键词：螺原体；生物学特性；油菜；杜鹃；红花酢浆草中图分类号：Q939.34文献标识码：A文章编号：0001-6209(2008)09-1141-06螺原体(Spiroplasma)是硬壁菌门(Firmicutes)柔膜菌纲(Mollicutes)的一类螺旋状、无细胞壁的原核生物，它们基因组小（0.78~2.22Mb），是能独立生活和自我复制的最简单的原核微生物[1]。作为一类重要的微生物资源，由于其形态结构和营养代谢的特点，螺原体常作为研究生物膜和运动的模式生物受到关注[2,3]。绝大多数螺原体分离自昆虫和扁虱，在几种植物体内或花表也分离到螺原体[4]。有些螺原体对宿主有致病性，如螺原体Spiroplasmaapis和S.melliferum导致蜜蜂（Apisspp.）“五月病”（Maydisease）和“爬蜂病”，S.citri，S.kunkelii和S.phoneiceum分别引起柑橘顽固病(Citrusstubborn)、玉米矮缩病(Cornstunt)和紫苑黄化病(Asteryellow)，而大多数螺原体和宿主之间是共生(Mutualism)或互生(Commensalism)关系[4]。有许多研究证实花上螺原体与昆虫之间有密切的关系，Clark认为蜜蜂螺原体在蜜蜂体内出现和消失的时间与植物开花时间一致表明花可以作为传播中间体[5]，这种推测得到Davis等的支持，后来大量植物花螺原体的发现进一步支持了这种观点[6]。目前一般观点认为，花上螺原体可能是携带螺原体的昆虫在取食花蜜或花粉时留下的,花仅是作为定居场所在昆虫传播中起作用，这种推测也被食叶昆虫及非虫媒花上没有发现类似的螺原体所支持[4]。但是，直接从植物花分离得到的螺原体从哪里来？在自然界中如何传播？螺原体是否在植物花上增殖？是否进入植物体内？是否对植物产生什么影响？这些问题目前尚不清楚。国际上已有36个螺原体有效种的记录，但国内有关螺原体的研究极少[7,8]。为获得我国的螺原体资源，并为以后进一步研究螺原体与宿主之间的相互关系，2005年3~7月间，我们从江苏省南京市东郊采集了大量的植物花分离得到4株螺原体，并研究了其基本生物学特性。1材料和方法1.1材料1.1.1供试植物花和螺原体菌株：用于分离螺原体的植物花有油菜(Brassicanapus)、杜鹃(Rhododendronsimsii)、红花酢浆草(Oxaliscorymbosa)、牡丹(Paeonasuffruticosa)、现代月季(Rosahybrida)、虞美人(Papaverrhoeas)、诸葛菜(Orychophragmusviolaceus)、唐菖蒲(Gladiolushybridus)等80多种，都是在华东地区于3~7月间开花的植物。用镊子随机采集盛开...