引物的设计总结VIP免费

1 引物设计总结寡核苷酸的优化设计郑仲承( 中国科学院上海生命科学院生物化学和细胞生物学研究所，上海200031 ) 在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大 DNA片段等实验中，都需要使用寡核苷酸作为探针或引物，而对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时，常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验的工作量，还可能一无所获。怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。1. 估测可能形成的DNA或 RNA双链的稳定性寡核苷酸，无论是DNA的或者 RNA的，都有形成双链结构的潜在可能性，正如下面反复提到的，这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。所以，预测这种结构的稳定性对设计和优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由能( Δ G)来表示。现在，大多采用 Breslauer等人提出的，以最接近的相邻核苷酸的动力学数值( 自由能 ) 来预测双链稳定性的方法。为简化起见， 所有的计算都在25 ℃条件下进行。 此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是：此主题相关图片如下：Δ G(kcal/mol) 例如，双链d(ACGG／ CCGT)的 Δ G是：Δ G(ACGG)＝Δ G(AC)＋ Δ G(CG)＋Δ G(GG)＝－ (1.3 ＋3.6 ＋3.1) ＝－ 8.0 kcal/mol 此计算方法特别适用于测定其3′ 末端会形成双链的引物的相容性。也可以用来计算发夹环结构的Δ G。不过，这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。如 3 个核苷酸时为5.2 kcal/mol；4 个时为 4.5 ；5 个为 4.4 ；6 个是 4.3 ；7 和 8 个为 4.1 kcal ／ mo1。2. 选择引物的一般规则设计和选择引物时有5 个要素必需注意。2.1 引物的 3′ 末端不互补引物的 3′ 末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物的得量。有实验表明，3′ 末端双链的Δ G是 0～－ 2 kcal/mol时， PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6 时只有 40%，到－ 8 时少于 20%，而－ 10 时，接近于 0。虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用Taq 聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在很短的时间内就识别3′ 末端互补的双链区...