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Western blot 步骤： 配胶 制胶 跑胶 转移胶（转膜） 封闭和孵抗体 扫膜 一.配胶 这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS 聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。 1 .分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度） 2 .浓缩胶 均可事先配好（除AP 及TEMED 外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸 3 分钟），加入 10%AP（0.7~ 0.8:100, 分离胶浓度越高AP 浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用 0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用 0.8：1000） PAGE 配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜— — 最好用小指管配AP（写日期）保存在-20 度，超过2 周的AP 扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP 都别用， 二制胶 1.灌入2/3 的分离胶后应立即封胶，即压线。30 分钟 胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS 封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。 如用醇封胶需用大量清水及ddH2O 冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴 10%的AP 最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉 过硫酸铵（APS）(10%;w /v) 取 3g 过硫酸铵，溶于去离子水，至终体积为 30mL。此溶液 4℃下在短暂的数日内是稳定的，但建议，对每一组新胶均应新鲜配制 但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气 2.灌积层胶5%（统一） 40min 说明：可延长，宁长勿短。防止凝固不均匀，形成月牙状。 三．跑胶 1.配制ru nning bu ffer ： 1) tris 3g； 2) Glycine:甘氨酸 14.4g 在被分析的蛋白质稳定的pH 范围，凡是不与 SDS 发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键 的。Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。 如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于 15 kDa的蛋白样品，可以使用SDS-尿素系...