生物化学实验报告姓名： 专业： 院系： 学号：实验一 蛋白质分子量测定------凝胶层析法一、实验原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。凝胶是由胶体溶液凝聚而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为 Sephadex 型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后，柱床总体积称为“总体积”，以 Vt 表示。实质上 Vt 是由 Vo，Vi 与 Vg 三部分组成，即 Vt=Vi+Vg+Vo。Vo 称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi 为内体积，即凝胶颗粒内部 所 含 水 相 的 体 积 ， Vg 为 凝 胶 本 身 的 体 积 ， 因 此 Vt-Vo 等 于Vi+Vg。洗脱体积与 Vo 及 Vi 之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中 Ve 为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd 为样品组分在二相间的分配系数，也可以说 Kd 是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无光，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd 可通过实验求得，上式可改写成：Kd=(Ve-Vo)/Vi上式中 Ve 为实际测得的洗脱体积；Vo 可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实...
