各种酶活性测定方法

抗坏血酸过氧化物酶(AＰX)活性得测定 过氧化氢酶(CＡT)活性测定 过氧化物酶(POＤ)测定方法 超氧化物歧化酶(ＳOD)活性测定小组第一次讨论结果:一、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性得测定1、原理APX 就是植物体内重要得抗氧化酶， 主要功能就是分解H２O2， 此过程通过抗坏血酸- 谷胱甘肽循环来完成。此外, 它还直接参加抗坏血酸得氧化还原代谢, 而抗坏血酸能有效地清除多种活性氧自由基。因此,ＡPX被认为与果实得抗热性直接相关。２、所用方法（1)采纳碘液滴定法:称取新奇材料1 ｇ，剪碎置研钵中，加少量石英砂及ｐH值６、0 得磷酸盐缓冲液,迅速研磨成浆,20 ℃下浸提30 miｎ，中间摇动数次,３00０ r /ｍiｎ 离心后保留上清液即为酶液。反应底物为抗坏血酸，加入酶液2 mL,２0 ℃下反应10 min 后，立即加入偏磷酸1 ｍL,终止酶得活动,抗坏血酸被消耗得量,可用碘液滴定剩余得抗坏血酸来进行测定，加淀粉溶液几滴作指示剂,以碘液滴定出现浅蓝色为止，记录滴定值,用底物被消耗得量来表示APX 得活性。每个处理设3 个重复。(2)紫外吸收法:称取 1g 芥蓝叶片组织，加入 1、6 m Ｌ预冷得磷酸缓冲液(PB Ｓ-K)(pH ７、8)提取液(含１ m ｍ ol·Ｌ-1 A ｓ A,3 ｍ mo ｌ·L-1β-巯基乙醇,0、5 mmol·Ｌ-1PMＳ F,2% P Ｖ P，１ m Ｍ EDTA）。用液氮研磨,提取液于 4,℃ 12 ０ 0 ０×g 离心20 min,上清液用于酶活性得测定。取 0、10 ml 酶液(可视情况调整）,加入１、70 ml 含 0、1 mM E Ｄ TA－N ａ２得 PBS(0、05 mol/L，pH7、0）,再加入0、10 ml 5 mM 得Ａ s Ａ,最后加入 0、１ 0 ml ２ 0mM H2O2,立即在２ 0℃下测定 D2 ９ 0(紫外）值在一定时间内得变化,计算单位时间内 AsA 减少量，并求酶活性(室温下测定,缓冲液调零)。AP Ｘ总活性(uM·g-1·m ｉ n-1) = OD×△Ｖｒ/ (Ａ×d×Vt×W× t)△ △OD：反应时间内吸光度得变化; △t:反应时间，m ｉ n;Ｖ r:提取液体积,mL； A:消光系数,2、8 ｍＭ-1﹒ｃｍ-１；d:比色杯厚度，1 ｃｍ； V ｔ:测定液体积,mL;W:样品鲜重,ｇ。二、 过氧化氢酶(CAT)活性测定1、原理过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白，含有铁,能够催化过氧化氢分解为水与氧分子,此过程中起传递电子得作用,过氧化氢既就是氧化剂又就是还原剂,因此可根据Ｈ 2O2得消耗量或 O2得生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量)得过氧化氢溶液,经酶...