实验一植物核酸提取一、植物叶片总DNA的大量提取【实验原理】CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNA充分溶解在液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。【实验目的】利用CTAB法从植物叶片组织中提取高质量DNA。【主要试剂】1.CTAB提取缓冲液：1.4MNaCl，100mMTrispH8.0，2%CTAB，20mMEDTA，0.5%NaHSO3，2%β-巯基乙醇。室温保存，五年有效。2.氯仿：室温保存，五年有效。3.无水乙醇：-20℃保存，五年有效。4.70%乙醇溶液：将无水乙醇和H2O按7:3混合。室温保存，五年有效。5.TE缓冲液（250ml）：2.5ml1MTris-HCl，pH8.0（10mM）；0.5ml0.5MEDTA，pH8.0（1mM）；加H2O至250ml。室温保存，五年有效。【操作步骤】1.在液氮中将叶片研磨粉碎，取1-4克样品于合适的离心管中（初始样品为1克，用13ml管；初始样品>1克，用50ml管）。2.每1克样品加入5mlCTAB提取缓冲液和25-50ugRNaseA（可选），颠倒混匀，60-70℃水浴孵育40-50min，期间混匀2-3次。3.从水浴中取出样品，冷却至室温。可选：20-25℃，3000g离心3min，转移上清液到新管中。4.每1克样品加入5ml氯仿。颠倒混匀2-3min。5.20-25℃，10300g离心8-10min，转移上清液到新管中。6.加入等体积氯仿，重复步骤4和5。可选：步骤4和5可重复多次，直到获得澄清的上清液。7.加入等体积的无水乙醇，轻缓颠倒混匀，直到沉淀出现。8.沉淀DNA。方法1：钩出DNA。（1）用接种环钩出DNA（可选：1000g离心1min，富集DNA）。（2）将DNA（可将多个样品的DNA合并成一管）加入70%乙醇溶液中。初始样品为1ml，加入装有1-1.5ml70%乙醇的1.5ml离心管；初始样品>1ml，加入装有10-12ml70%乙醇的50ml离心管。（3）20-25℃，13000rpm（1.5ml管）或5100g（50ml管）离心5-7min，弃上清。可选：用上述相同体积的70%乙醇重复洗涤DNA沉淀1次。可选：接步骤（3），以相同速度离心1-2min，用吸头吸尽乙醇。方法2：离心沉淀DNA。（1）20-25℃，5100g离心5-7min，弃上清。（2）加入5-6ml（13ml管）或10-12ml（50ml管）70%乙醇溶液洗涤DNA沉淀，20-25℃，5100g离心5-7min，弃上清。可选：重复步骤（2）1次。可选：接步骤（2），以相同速度离心1-2min，用吸头吸尽乙醇。9.干燥DNA。真空干燥≤10min，空气干燥≤1h（30min左右），DNA过度干燥会导致难以溶解。10.每1ml样品加入100-250ulTE缓冲液溶解DNA。也可适当增加TE缓冲液用量，或将DNA溶液置于70℃孵育1-4h，促进DNA溶解。相同样品可合并。可4℃过夜溶解。11.DNA溶解完全后，将溶液转入1.5ml离心管。测定DNA浓度后，根据需要，将DNA溶液分装（每管分装1个酶切体系所需DNA量，10ug/管），保存于4℃、-20℃或-80℃冰箱。DNA样品应有唯一性编号，并与原始样品相对应。12.跑0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度，ND1000分光光度计测量DNA浓度。OD230/OD260>0.4～0.5说明有盐残留OD260/OD280=1.7～1.9说明纯度很好OD260/OD280<1.7说明有有蛋白质污染OD260/OD280>2.0说明有有RNA污染【注意事项】1.研磨前，研钵、离心管、药勺等物品均需用液氮预冷彻底，研磨过程应保证样品不融化，研磨应足够细。2.提取过程中，应采用颠倒混匀方式，而不能涡旋混匀，所有过程保证离心管盖盖好，防止液体漏出。3.CTAB缓冲液裂解温度一般为65℃，孵育结束后，应彻底冷却至室温，该步骤可持续1-2h。4.加入氯仿后，应彻底混匀2-3min。5.钩出DNA时，动作要轻缓，洗涤后要除尽乙醇。6.TE缓冲液适用于基因组DNA、质粒DNA长期保存，ddH2O适用于短期保存。DNA溶解后，轻缓晃动...
