河北师范大学细胞工程论文摘要及总结姓名曾媛班级08级生技学号2008011175小鼠与人类ES细胞的分离与培养论文摘要昆明小鼠ES细胞的分离培养及鉴定张廷龙1,董雅娟1*,柏学进1,赵晶1,2,岳福杰3,史文升1,龚宜超1(1.青岛农业大学动物胚胎工程中心,山东青岛266109;2.西北农林科技大学,陕西杨凌712100;3.荣成市出入境检验检疫局,山东荣成265300)摘要[目的]摸索一种适合昆明小鼠ES细胞分离培养的方法,以提高昆明小鼠ES细胞的建系率。[方法]分别采用5种方法分离ICM和ES细胞集落,摸索了以BMSCs作为饲养层时,丝裂酶素处理的合适时间。[结果]连续消化法要明显好于其他4种方法。MMC处理BMSCs1、1.5、2h时效果较好,3个时间点无显著差异(P>0.05)。mMEF作为饲养层与BMSCs作为饲养层时获得5代ES细胞相比差异不显著(P>0.05)。[结论]连续消化法分离ES细胞效率较高,饲养层采用MMC处理1~2h的BMSCs饲养层或常规mMEF饲养层对昆白小鼠ES细胞无明显影响。关键词:昆明小鼠;ES细胞;BMSCs;ICM昆明小鼠胚胎干细胞的分离、培养与鉴定作者:赵晶（西北农林科技大学）摘要本研究的目的是建立有效的昆明小鼠胎儿成纤维细胞（MEF）饲养层培养体系，用于分离和培养小鼠胚胎干细胞（ES细胞）的研究，筛选出更适合于昆明小鼠ES细胞的克隆培养体系，为进一步建立昆明小鼠ES细胞系奠定基础。1．分别选取妊娠11d，14.5d和16d的孕鼠胎儿分离成纤维细胞，比较分离不同日龄胎儿的成纤维细胞增殖及纯化情况，以及观察不同接种密度，成纤维细胞体外培养生长状况。选择成纤维细胞分离培养的最适胚龄和最佳培养条件。试验结果显示，14.5d的孕鼠胎儿分离培养成纤维细胞效果最好。可分离到大量的成纤维细胞，杂细胞少，并且细胞增殖快。生长旺盛、已纯化的第三代成纤维细胞最适宜做ES细胞的饲养层。2．采用全胚培养法，比较桑椹胚和囊胚对ES细胞分离培养的影响。将桑椹胚和囊胚分别培养在饲养层上，桑椹胚的贴壁率、内细胞团（ICM）增殖率和ES细胞集落的出现率均显著低于囊胚（P0.01﹤）。由此看出，试验中获得的小鼠囊胚更适合作为ES细胞分离克隆的材料，并且妊娠第4天采集的胚胎囊胚率高。3．比较三种不同浓度消化液：0.25%胰酶+0.04%EDTA，0.05%胰酶+0.04%EDTA和0.02%胰酶+0.01%EDTA，对内细胞团、ES细胞集落分离克隆的影响。试验结果显示，0.02%胰酶+0.01%EDTA是较好的ES细胞消化液，对细胞的损伤力小，且传代后ES细胞集落形成能力也较高；对没有消化离散的大的细胞团块，吸出后用机械法切割。4．选取生长旺盛并且已纯化的第3代成纤维细胞，经丝裂霉素-C处理后，用细胞计数板计算细胞数，分别按密度为1×104个/mL，1×106个/mL和1×108个/mL接种，制备饲养层，观察不同密度饲养层的生长状况和不同密度饲养层上囊胚、内细胞团及胚胎干细胞的克隆生长情况。试验结果表明，囊胚在密度为1×106个/mL的饲养层上，贴壁率和内细胞团孵出率分别为(97.0±3.606)%，(96.3±2.887)%，显著高于其他两组；密度为1×106个/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104个/mL（差异极显著，P0.01﹤）和1×108个/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异显著（P0.05﹤）；而1×104个/mL饲养层和1×108个/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著（P0.05﹥）。因此，以1×106个/mL密度接种的成纤维细胞作为饲养层，最适合用于分离培养昆明小鼠ES细胞，有利于囊胚的发育、内细胞团的增殖、促进ES细胞的增殖，并起到抑制其分化的作用。5．对分离克隆出的ES细胞进行细胞形态、集落形态、碱性磷酸酶测定、核型分析以及体外分化能力加以鉴定。分离得到的ES细胞有典型的形态学特征，集落呈鸟巢状，边缘清楚，表面平滑，结构致密，其隆起生长，细胞之间界限不清楚；碱性磷酸酶染色呈强阳性，ES细胞集落具有正常的二倍体核型，可形成拟胚体。表明培养扩增后的细胞具有ES细胞的典型特征。关键词：昆明小鼠；胎儿成纤维细胞；胚胎干细胞；饲养层昆明系小鼠胚胎干细胞分离培养的优化白莹敏1,李跃民1*,邱小燕1,肖雄1,武建中2(1.西南大学动物胚胎工程试验室,重庆北碚400716;2.宜春学院生命科学与资源环境学院,江西宜春336000)摘要:以昆明系小鼠为对象,经过丝裂霉C处理成...
