注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系，TEL:010-68498287；E-mail:techserv@promega.com.cn技术手册号码：CTM042第1页共23页pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体系统原英文技术手册号码：TM042产品A1360，A1380，A3600和A3610的操作指南。所有技术资料均可在www.promega.com网站上得到，请访问公司网站以证实您所使用的技术手册为最新版本I.描述……………………………………………………………………………………..2II.载体图谱………………………………………………………………………………..3III.产品组分……………………………………………………………………………..6IV.采用pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体和2×快速连接缓冲液进行连接……….7A.操作步骤…………………………………………………………………………7V.采用pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体的连接反应产物的转化………………...7VI.注意事项…………………………….……………………………………………….8A.PCR产物纯度…………………………………………………………………...8B.平端PCR产物…………………………………………………………………9C.优化插入片段与载体的摩尔比…………………………………………………10D.有插入片段的转化子的筛选……………………………………………………11E.实验对照………………………………………………………………………...11VII.重组质粒DNA的提取…………………………………………………………….…12VIII.pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体单链DNA的制备….…………………………12IX.疑难解答………………………………………………………………………………13X.参考文献………………………………………………………………………………15XI.附录A：载体序列及限制性酶切位点………………………………………………16A.pGEM®-T载体序列………………………………………………………………16B.pGEM®-T载体限制性酶切位点…………………………………………………17C.pGEM®-TEasy载体序列……………………………………………………….18D.pGEM®-TEasy载体限制性酶切位点………………………………………….19XII.附录B：参考资料…………………………………………………………………..21A.缓冲液及溶液配方………………………………………………….…...………21B.相关产品…..……….……………………………………………….…...………22注意：本中文操作手册仅供实验参考，在实际使用中请详细对照原英文技术手册TM042。如遇到问题请与Promega公司北京办事处联系，TEL:010-68498287；E-mail:techserv@promega.com.cn技术手册号码：CTM042第2页共23页I.描述pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体系统可用于PCR产物的克隆。这两种载体是通过EcoRⅤ酶切pGEM®-5Zf(+)和pGEM®-TEasy载体，并在3’末端加入胸腺嘧啶构建的。插入位点3’-T突出端可提高PCR产物的连接效率，因为3’-T突出端可以防止载体的自身环化，并且为热稳定性聚合酶（1，2）产生PCR产物提供一个匹配碱基。如表1总结的，这些聚合酶常常以不依赖模板方式在扩增产物的3’端加上一个脱氧腺苷酸（3，4）。pGEM®-T和pGEM®-TEasy高拷贝数载体包含有T7和SP6RNA聚合酶启动子，其侧翼和多克隆位点区相接，多克隆位点区位于β半乳糖苷酶的α肽编码区内。α肽插入失活允许在指示培养基用颜色直接筛选重组克隆。另外这两个载体的多克隆位点区的限制性酶切位点适用于采用Promega公司Erase-a-Base®系统（产品目录号#E5750）产生一系列巢式缺失体。pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体的多克隆位点区含有一些这样的限制性酶切位点，采用这些酶进行单酶切消化即可释放插入片段。如pGEM®-TEasy载体多克隆区的EcoRⅠ、BstZⅠ和NotⅠ酶切位点。而pGEM®-T载体多克隆区只有一种这样的酶切位点BstZⅠ。这两种载体也可选用适当的双酶切消化释放插入片段。pGEM®-T和pGEM®-TEasy载体含有丝状噬菌体f1复制起始子，可用于制备单链DNA(ssDNA参见第Ⅶ部分)。单链DNA分子对应于图1底部...
