常用蛋白标签VIP免费

2323表9His-tag被认为是蛋白纯化的首选标签的五个因素原文检索：http://www.promega.comhttp://www.fulengen.comhttp://tong.dxy.cn/info/infoSupplyView.htm?id=50c35b041b977f34011b97c7de673b66http://www.hopebio.com/newEbiz1/EbizPortalFG/portal/html/InfoContent.html?InfoContent150_action=show&InfoPublish_InfoID=c373e90ab872ab868ffaaf954792611cLos,G.V.etal.(2005)HaloTag™InterchangeableLabelingTechnologyforcellimagingandproteincapture.CellNotes11,2-6.PuckTT,etal.GeneticsofsomaticmammaliancellsIII.Long-termcultivationofeuploidcellsfromhumanandanimalsubjects.J.Exp.Med.108:945-956,1958.PubMed:13598821CHO-K1细胞小词典小词典CHO-K1细胞是实验中十分常用的一个细胞株，在生物制药中的应用也非常广泛。该细胞株培养条件简单，贴壁强度适中，比较容易转染，很适合用它来研究一般哺乳动物基因的功能。来源：中国仓鼠（Cricetulusgriseus）卵巢形态：表皮细胞生长特性：贴壁CHO-K1由CHO衍生而来，CHO是T.T.Puck在1957年从一只成年中国仓鼠的卵巢中获得的。二、常用蛋白标签1.His-tag——历久弥新的6组氨酸标签金属螯合亲合层析，又称固定化金属离子亲合层析（Immobilizedmetalionaffinitychromatography,IMAC），是近30年发展起来的一种新型分离技术。最早由Paroth等人提出[1]。该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合，其中以配价键结合为主，而且这其中又以6组氨酸标签（His-Tag）应用最为广泛。以His-Tag纯化标签结合金属螯合亲合层析，为重组蛋白质的分离纯化提供了一个有力的工具。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，上样条件可选择范围广，在高盐、一定浓度的变性剂以及去垢剂的条件下，带6His纯化标签的蛋白质都可以和亲合填料特异性结合，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一[2]。1.1His-tag是蛋白纯化的首选标签SusanneGraslund等人[3]在对10,000多个不同蛋白的表达纯化进行总结，认为His-tag是蛋白纯化的首选标签，主要有五方面的因素（表9）。N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；采用固定化金属离子亲合层析纯化His-Tag融合蛋白操作简便；His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，而不象GST标签那样容易形成二聚体，从而影响蛋白的特性；His-Tag非常小，不会改变目的蛋白自身的可溶性，相反一些大的标签如MBP，可大大提高融合蛋白的可溶性，尽管目的蛋白本身是不可溶或者折叠不正确；His-Tag非常小，在融合蛋白结晶后对蛋白结构没有影响。生命奥秘www.lifeomics.com24生命奥秘www.lifeomics.com241.2His-tag亲和层析填料His-tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，包括Ca2+、Mg2+、Ni2+、Co2+等，其中以镍离子使用最为广泛。镍琼脂糖凝胶FF的配基是最经典的IDA，镍离子有六个螯合价位，Ni-IDA螯合了三价，剩余三价，而Ni-NTA螯合了四价的，剩余是两价。因此，Ni-IDA琼脂糖凝胶作用力要比Ni-NTA琼脂糖凝胶的强。也正因为这个原因，IDA的载量要比NTA高，而在同样条件下Ni-IDA洗杂质和目标蛋白的要比Ni-NTA的咪唑浓度高。但是NTA的填料更稳定，能耐受更强的还原剂，更不容易脱落。图30Ni2+结构图。图片来源：www.qiagen.com和www.gehealthcare.com固定化金属离子亲合层析（IMAC）是非常稳定的，但在有螯合剂的情况下其金属离子就会脱落，所以在纯化His-Tag融合蛋白时，不能有任何的螯合剂存在。AudurMagnusdottir等人认为，在E.coli的裂解液普遍存在一些非特异的弱螯合剂，如在三羧酸循环中产生了二羧酸类物质；E.coli在面临某些压力情况下，会产生高特异性的金属螯合剂——Metallophores，这是由于这些螯合剂的存在导致His-Tag融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。这些螯合剂一般存在于细菌的细胞周质中，通过一个简单的步骤就可除去这些螯合剂，使得His-TagTM蛋白的纯度和产量得到提高[4]。产量增长倍数全部裂解...