����年!卷期一∀!一#∀�鼻粘膜组织培养中国人民解放军总医院耳弄咽喉科研究所∃北京�##∀%!&王丰综述苏振伦审校〔摘要∋到目前为止,人类气道上皮细胞培养有四种方法。�利用外植块培养法�成纤维细胞滋养层支持法�!气液界面培养法�∀分离细胞直接种植法。利用鼻粘膜组织培养研究了上皮受损后的恢复过程,观察到速尿能抑制人类鼻粘膜细胞前列腺素#∃的合成。鼻粘膜腺体细胞的分离达到了精细的程度。乙酞胆碱能调节鼻粘膜腺细胞内游离钙%民&,∋〕(),鼻粘膜浆液腺细胞∗+一通道的激活依靠乙酞胆碱诱导的细胞内,∗&−∋.,的升高,/0一大环内醋类抗生素能抑制此种∗+一流。鼻粘膜上皮细胞∗+一的分泌受123和423的影响。近/5余年,人类鼻腔粘膜组织的培养方法及其生化和组化研究取得了较大进展�鼻腔粘膜细胞的分离达到了精细的程度,并对其离子通道的特性及调控机制进行了研究。现就近年来上述两个方面的研究进展进行综述。【奔粘膜组织培养及其组化和生化研究】人类气道上皮培养目前有四种基本方法。第一种系利用外植块培养法,对其周围生长晕中不断增长的细胞进行培养�第二种方法使用成纤维细胞滋养层支持分离细胞的生长�第三种为气液界面培养法川,这种方法的步骤如下∃人鼻粘膜取自患慢性鼻阻塞或行鼻整形手术患者的下鼻甲,切下的组织立即放入67+89:;’<改良#&=+9’<培养基中%6>#>),其中含有青霉素%−;;4?≅+),链霉素%Α55拌=?≅+),庆大霉素%/55拜=?≅+),二性霉素Β%5ΧΔ拼=?≅+)。以6>#>洗三次,去除血液和粘液,去掉出血和坏死组织,以0≅≅活组织检查钻切下全厚鼻粘膜片%包括鼻粘膜和粘膜下层),将这些粘膜片移植到+Ε+Ε;ΧΦ:≅含有胶原的明胶海绵块上,明胶海绵以6>#>%加入/5Γ热灭活胎牛血清和Δ5拜=?≅+庆大霉素)预水化至少0小时。粘膜块%每个明胶海绵块放一片粘膜)被单个放在平皿内,平皿充以适量培养基以保证上皮位于液相之上,使组织块的上皮层向上在气液界面,粘膜下层向下在明胶海绵里。培养基由6>#>加丙酸钠%ΗΧΦΙ?ϑ),6一葡萄糖%/Ι?ϑ)、ϑ一谷氨酸胺%−≅≅;+?ϑ)、青霉素Κ%+;;4?≅+)、链霉素%/55拌=?≅+)、庆大霉素%Δ5拼=?≅+)、二性霉素Β%5ΧΑΔ拌=?≅+)和/5Γ热灭活胎牛血清。培养物在加湿的充有ΙΔΓΛ∃和ΔΓ∗Λ∃的孵箱里可存活达ΦΑ小时。以单克隆抗体Μ(一ΝΦ为标记指示细胞增生程度。结果显示,培养0小时后,在整个固有层上面出现了一层连续的增生细胞。Α0小时后,Μ(一ΝΦ染色阳性细胞呈不连续的细胞丛,沿基底膜分布�0Ο小时和ΦΑ小时后仅有个别增生细胞出现。与其它方法相比较,这种方法使鼻粘膜细胞在无损伤的全厚粘膜片上接近于生理状态的环境下生长,能反应在体的情形,随着技术的逐步完善,为鼻粘膜生理学和病理学研究提供了很好的模型。第四种鼻粘膜组织培养方法则直接将分离细胞种植在培养皿里,不加成纤维细胞滋养层,不带移植组织。这种方法的具体操作如下∃以蛋白酶处理法分离细胞,将取好的人鼻粘膜组织以加有Ν54?≅+青霉素,Ν5拌=?≅+链霉素,Δ5拼=?≅+庆大霉素的Π;Θ+(<’<改良低限量#&=+9无钙培养基%>#>)漂洗ΑΡΗ次,然后置入含有5Χ/Γ蛋白酶的>#>孵化/Ν小时,温度为0℃。再加入/5Γ胎牛血清%ΣΒΤ),轻轻振荡将上皮细胞分离出来,然后以孔径05Ρ/55拼≅的过滤网过滤,在0℃下离心%/Δ5Ι,+;≅(Υ),沉淀重新放入一。ΓΣΒΤ一>#>培养基中再次离心,将沉淀物制成细胞悬液后进行培养。ς7等川于/ΙΟ0年建立了用于培养和繁殖人类鼻粘膜上皮细胞的无血清Σ,Α基础培养基,其中加入胰岛素%ΩΥ<)转铁蛋白%2Ξ)、上皮细胞生长因子%#ΚΣ)、氢化可的松%Ψ∗)、霍乱毒素%∗2)、三碘甲腺原氨酸一∀(一国外医学耳鼻咽喉科学分册∃)!&和牛下丘脑提取物∃∗+,&,他们在这一实验中观察到七种附加营养成分必不可少,无血清系统较含血清系统更有利于人类鼻粘膜上皮细胞的生长与分化,血清对鼻粘膜上皮生长具有抑制作用。形态学研究表明,纤毛与粘液在培养过程中∃一周内&消失,但若用剥掉粘膜的兔气管移植物作诱导,人鼻粘膜上皮不仅能很好地生长、分化,且具有粘液毡和纤毛运动功能,−.等用透射电镜在培养组织中发现了无定形物质,生化分析其为透明质酸∃+/...
