第八章大肠杆菌基因表达系统VIP免费

第八章大肠杆菌基因表达系第八章大肠杆菌基因表达系统统克隆基因的表达：外源基因在宿主细胞中表达。外源基因表达载体重组载体导入宿主细胞在宿主细胞中表达出蛋白质提取蛋白宿主细胞：原核细胞或真核细胞。一、原核表达系统的注意事项1.外源基因不能带有内含子。2.必须用cDNA或者是化学合成的基因。3.不能直接用真核基因组DNA。4.必须利用原核细胞的调控原件（启动子等）5.防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。除了具备克隆载体具备的条件外，还应具备以下条件：1.强启动子、强转录终止子2.可诱导性3.合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等二、理想原核表达载体具备的基本特征AdividingE.coli原核或噬菌体启动子MCSSD序列终止子①必须是一种强启动子②应呈现低水平的基础转录③应是可诱导型的用温度或化学试剂诱导。（1）最佳启动子必须具备的条件基因工程常用的原核启动子PlacO目的基因乳糖启动子lac色氨酸启动子trpP1OtrpE目的基因cI857:cI857:噬菌体启动子是PL42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录cI857cI857PL外源基因28oC时阻遏PL，外源基因不转录。三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位三、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位1.细胞质中表达（1）包涵体（inclusionbody）是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。形成原理未知。使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞回收的蛋白生物活性差。②缺点①优点2.周质中表达（1）周质（periplasm）格兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。优点：容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-内酰胺酶（lactamase）（3）常用的原核信号肽①大肠杆菌的信号肽：能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。（2）信号肽（signalpeptide）一般位于N端。②金黄色葡萄球菌的蛋白A。鼠源RNase、人生长激素信号肽。也能在细菌中起作用。（2）真核信号肽用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白；使表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。3.胞外表达或与细菌素释放蛋白（bacteriocinreleaseprotein)共表达。载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG优点：四、几种类型的原核表达载体1.非融合型表达载体缺点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。pKK223-3载体组成结构：条件：必须选择一个有lacI的宿主菌。tacPLacOS-D插入位点区rrnBT宿主lacI表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）阻遏物IPTG载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。如：pINIII系列：2.分泌型表达载体pINIII-comA1,pINIII-comA2,pINIII-comA3,Ompa：大肠杆菌外膜蛋白基因IpplacPlacOS-D/ATGompa插入位点组成结构Ipp：脂蛋白基因启动子pINIII-comA1以pBR322为基础构建的。调节基因不必借助于宿主的lacI.表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。3.融合蛋白表达载体系统----pGEX系列（1）优点便于融合蛋白的分离和纯化。lacItaclacOS-D/ATGGST插入位点TGAlacP融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）GST融合蛋白用GlutathioneSepharose亲和层析柱分离纯化。（3）产物提纯（2）组成结构（4）产物分离用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。柱（column）GST外源蛋白凝血酶外源蛋白柱（column）GSTGST洗脱柱（column）可再利用pGEX插入区：pGEX-1TCTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGAATTCATCGTGACTGACTGACGALeuValProArgGlySerProGluPheIleValThrAspEcoRIBamHI凝血酶CTGGTTCCGCGTGGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGACTGACGLeuValProArgGlySerProGlyIleHisArgAspEcoRIBamHI凝血酶ATCGAAGGTCGTGGGATCCCCGGGAATTCATCGTGACTGACTGACIleGiuGlyArgGlyIleProGlyAsnSerSerEcoRIBamHIXa因子pGEX-2X的插入区：pGEX-3X的插入区：SmaISmaI（5）其他融合蛋白系统His-tag（组氨酸标签）：在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋...