PFGE（脉冲场凝胶电泳）标准操作规程(SOP)关键词：PFGE，脉冲场凝胶电泳目的：运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型图谱分析：采用“PFGE脉冲场凝胶电泳分子分型识别系统”（官微：PFGE_CHINA）进行图谱分析。系统主要功能是PFGE图谱分子分型在线识别和处理，提供二叉层级聚树，MLVA、MLST字符类型的最小生成树，SEQUENCE基因片段类型的亲缘树计算和图形绘制，用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源以及有效控制疫情。第一天一、胶块的制备1、在Falcon2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml细胞悬浊液（CSB）；2、在1.5mleppendorf管上标记好对应样品的名称；3、在模具上标记好对应样品的名称；4、用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，用bioMerieuxVitekcolorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。5、取400µl细菌悬浊液于相应的1.5mleppendorf管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。6、从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20µl蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。7、制备好1%SeakemGold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。8、在eppendorf管中加入400µl的1%SeakemGold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。注意事项：（1）用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。（2）细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。（3）在混合细胞悬浊液和1%SeakemGold：1%SDS时要避免气泡的产生。（4）混合物加入模具时不能产生气泡。（5）在加1%SeakemGold：1%SDS的过程中1%SeakemGold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。二、细胞的裂解1、在50ml的screw-captube上做好标记。2、配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液加入25µl蛋白酶K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。注意：蛋白酶K要置于冰上，配制好的细胞CLB也要置于冰上。3、每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。（1）可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。（2）一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。5、保证胶块在液面下而不在管壁上。6、将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。7、将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。三、洗胶块1、从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。注意：把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。2、每管中加入15ml预热的纯水。3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇10分钟。4、倒掉水，用纯水再洗一次。、5、倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇15分钟。6、倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。7、倒掉TE，加入10mlTE，放在4℃冰箱保存备用。注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。四、胶块内DNA的酶切1、在1.5mleppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。2、按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。试剂µl/胶块µl/10胶块纯水180µl1800µlBufferD20µl200µl总体积200µl2000µl注意：缓冲液要置于冰上。3、在每个1.5mleppendorf管中加入200µl缓冲液H的稀释液。4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。5、用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5mleppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。6、用同样的方法处理标准株H9812的胶块。7、将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。8、在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。试剂µl/胶块µl/10胶块纯水175µl1750µlBufferD20µl200µl酶（10U/µl）5µl50µl总体积200µl2000µl注意：（1）将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。（2）用枪头吸出缓冲液H，避免损伤胶块。9、每管加入200µl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部...
