1蛋白质蛋白质NN端测序技术介绍端测序技术介绍中中科大生命学院实验中心施荣华2蛋白质测序的发展简史蛋白质测序的发展简史��自从1967年Edman本人推出的第一台自动测序仪来，经历了液相测序仪——固相测序仪——气相测序仪的发展历程。�液相测序：样品一直处于溶液状态，样品没有耦联到任何载体上，样品容易损失。�固相测序：将蛋白质共价耦联于聚苯乙烯膜，微孔玻珠或PVDF膜上再进行序列分析的方法。此方法可避免因冲洗而使样品损失，同时在序列降解及冲洗步骤采取较剧烈的条件。�气相测序：蛋白质通过polybrene等载体吸附在化学惰性的玻璃滤膜上，偶联碱和裂解酸以气相方式转运，反应副产物和ATZ氨基酸通过有机溶剂以气相方式萃取,蛋白质本身不会丢失.3蛋白质和蛋白质和DNADNA测序比较测序比较4蛋白质蛋白质NN--端测序优劣势端测序优劣势�随着分子生物学的飞速发展，一种新的革命性的测定蛋白质顺序技术手段--DNA测序技术。它是根据已经测定部分氨基酸序列设计引物，扩增出其mRNA，从而推出蛋白的全序列技术.�从前面蛋白质测序和DNA测序比较,DNA测序比蛋白质直接测序有明显优势（蛋白测序的劣势：昂贵费时封闭不能测定）�但是通过测定基因编码导出氨基酸序列并不完全描述蛋白质的一级结构，蛋白质的直接测序仍有DNA测序具有的优势。�（1）确认某些蛋白质信号肽的起始和终点�（2）确认转译后被加工的氨基酸的位点�5蛋白质蛋白质NN--端测序优势端测序优势�（3）通过验证DNA测序得到蛋白质序列的正确性�（4）检验基因工程表达的结构，为寡聚核苷酸探针与引物合成提供依据�（5）测定活性多肽和小蛋白质序列更简捷�（6）联合质谱技术，确认S-S定位，位点的修饰(还原剂三羧甲基磷酸ＴＣＥＰ，烷化剂碘乙酰胺ＩＡＡ)6蛋白质，蛋白质，DNADNA和质谱测序技术比较和质谱测序技术比较�（1）蛋白质测序：N-端测序和C-端测序，Edman不能解决N端封闭肽的测序问题�（２）ＤＮＡ测序：对于转译后加工所导致的氨基酸残基的修饰无能为力。��（３）质谱测序：８０年代末出现的２大技术:电喷雾（ESI,electrosprayionization)质谱和基质辅助激光解吸电离－飞行时间（MALDI-TOF,matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime–of-flight),采用软“电离”的电离方式。需求样品量少，速度快，价格昂贵。7蛋白质蛋白质NN--端测序端测序--EdmanEdman降解法降解法�Edman降解法：�蛋白质测序技术最具有意义的发展是瑞典化学家Edman发展的以他名字命名的蛋白质N-端测序方法——Edman降解法。可以说Edman降解堪称有机化学成功的经典，经过几十年研究，发现其耦联试剂－异硫氰酸苯酯即Edman试剂仍是最适用的。8EdmanEdman降解的化学原理降解的化学原理�一Edman降解的化学原理�Edman降解进行蛋白质与多肽序列分析是一个循环式的化学反应过程。包括三个主要的化学步骤：（1）偶联：异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基反应�9EdmanEdman降解的化学原理降解的化学原理�（2）环化裂解：苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）环化裂解10EdmanEdman降解的化学原理降解的化学原理（3）转化：噻唑呤酮苯氨（ATZ）转化为苯异硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）11PProciserocise491491气相测序仪简介气相测序仪简介�目前蛋白质测序仪市场上90%都是有美国ABI(Appliedbiosystems)公司生产的,而491型蛋白测序仪是目前的主导型仪器.�基本结构:四个主要部件�(1)蛋白质测序仪主机�(2)140型微梯度运送系统�(3)785A型紫外检测器�(4)610A型数据分析软件12491491型蛋白质序列仪的结构示意图型蛋白质序列仪的结构示意图测序仪主机紫外检测器溶液运送系统（ＨＰＬＣ系统）13测序仪的基本操作步骤测序仪的基本操作步骤�(1)首先打开高纯氩气阀使分压为0.5MP,然后依次开泵,检测器和测序仪主机开关,等待检测器自检完毕后，开计算机.�(2)打开计算机操作软件到主菜单控制界面,按照操作指南准备测序前工作,如各种试剂和PTH-氨基酸配制装载,HPLC系统洗脱液的准备等，注意每次测序前一定要仔细观察每种试剂和洗脱液能够保证此次测序能够顺利完成。14测序仪的基本操作步骤测序仪的基本操作步骤�(3)样品上测序仪反应室前的预处理，...
