GST_talin1融合蛋白的原核表达及纯化VIP免费

收稿日期:2007-12-22;修回日期:2008-01-11作者简介:吴爽(1979-),女,硕士,助教,教学和研究方向,细胞生物学,E2mail:wushuang21977@163.com;通迅作者:耿建国(1955-),男,博士,研究员,研究方向,细胞粘连与迁移。GST2talin1融合蛋白的原核表达及纯化吴爽1,2,耿建国2(1广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州510006;2中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海200031)摘要:应用PCR方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX24T21中,获取人源的GST2talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用GlutathioneSepharose4B柱纯化,westernblot鉴定。克隆得到了一个2400bp的talin1的cDNA片断,重组质粒目的DNA测序正确,纯化出分子量约为12116kD的融合蛋白。用基因工程方法使GST2talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST2talin1融合蛋白。关键词:talin;P2选凝素;GST2融合蛋白;亲和层析中图分类号:Q51文献标识码:A文章编号:1008-9632(2008)03-0033-03P-选凝素(P-selectin)是一种由细胞产生的粘附分子(adhesionmolecules),存在于细胞表面,能够介导细胞与细胞间或细胞与基质间相互接触和结合。其在炎症反应、凝血机制、甚至在某些肿瘤转移等方面发挥重要作用[1]。一直以来P2selectin受到许多研究者的青睐。P2selectin分子的特性到目前为止,人们已有较丰富的研究。本实验室以P2selectin的cytoplasmicdomain为饵从人白细胞cDNA文库中筛选到几个基因,经测序可知其中之一为talin1(从第1672个氨基酸残基到蛋白末端)。因此本试验利用重组DNA技术,获得talin1的cDNA,构建了GST2talin1融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白,为进一研究talin1与P2selectin是否存在相互作用及相互作用机制,奠定了基础。1材料和方法1.1材料1.1.1菌株、质粒人源talin1的cDNA及融合表达载体pGEX24T21为实验室保存。DH5α及BL21大肠杆菌感受态购自上海申能博采生物公司。1.1.2生化试剂和分子生物学试剂引物由上海生工生物有限公司合成,限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Promega公司,1kbDNAMarker、DNA片断快速纯化及回收试剂盒购自北京鼎国生物技术公司,PCR试剂购自日本TAKARA公司,氨苄青霉素为上海华舜生物公司产品。1.2方法1.2.1目的基因的扩增及纯化根据已公布的人源talin1的cDNA序列设计talin1的引物,上游引物T1的序列为5′23′atcagtaggaattcatgcgggacctagaccagg;下游引物T2的序列为5′23′gaagtcatctcgaggtgctcatctcgaagctctg,在上下游引物中分别加入EcoRI和XhoI酶切位点。PCR反应总体积为50μL,包括ddH2O4015μL、10×buffer5μL、4dNTP1μL、上下游引物各1μL、模板1μL、LaTaq酶015μL。反应条件为:94℃2min,94℃50s、56℃50s,72℃2min,72℃5min,共35个循环。所获得的PCR产物以1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下,用DNA片断快速纯化回收试剂盒回收。1.2.2pGEX24T212talin1重组质粒的构建将纯化的PCR产物和pGEX24T21载体用EcoRI和XhoI双酶切后,分别回收酶切产物。取回收后的talin1片断815μL,载体片断015μL,10×T4DNA连接酶buffer1μL,T4DNA连接酶013μL,16℃连接过夜。1.2.3重组质粒的筛选和鉴定将连接产物全量转化入DH5α感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp)的LB上37℃筛选培养过夜。次日挑取单个菌落,培养12h后小量抽取质粒,用EcoRI和XhoI双酶切,筛选阳性重组质粒并送上海英骏生物技术有限公司测序。33第25卷第3期2008年6月生物学杂志JOURNALOFBIOLOGYVol125No13Jun,20081.2.4融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转化入BL21感受态细菌,在含有氨苄青霉素(Amp)的LB上37℃筛选培养过夜后挑取单个菌落,经小抽酶切鉴定后保存菌液。将保存的pGEX24T212talin1菌液经37℃过夜培养活化,以1∶200稀释接种于10mL的LB培养基中(含Amp100μg/mL),振荡培养3h至OD600≈016时,取出100μL的菌液作为阴性对照,然后加入终浓度为015mmol/L的IPTG,诱导培养4h,取菌液收集菌体,超声破菌后离心,保存沉淀和上清,8%的SDS2PAGE电泳后考马思亮蓝染色鉴定。1.2.5...