氨基酸分析--应用与实践VIP免费

氨基酸分析技术的应用与实践中国农科院饲料研究所刘庆生2005年6月28日氨基酸测定方法的基本框架‹氨基酸总量的测定(十八种氨基酸)常规酸水解氨基酸氧化酸水解测含硫氨基酸碱解测色氨酸‹游离氨基酸的测定添加氨基酸测定生物材料中的游离氨基酸测定蛋白水解氨基酸总量的测定‹常规酸水解—测定除色氨酸、含硫氨基酸以外的蛋白水解氨基酸（15种）‹氧化酸解用HBr做终止剂—可测定除色氨酸、酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸以外的蛋白水解氨基酸（14种）用偏重亚硫酸钠做终止剂—可测定除色氨酸、酪氨酸以外的蛋白水解氨基酸（16种）‹碱解测定色氨酸常规酸水解‹原理:蛋白质是氨基酸以α-氨基和α-羧基形成酰胺键，共价地结合形成的多聚物。因此测定氨基酸必须先水解，将氨基酸间的肽键打开，然后才能分离、测定。该法可测定15种氨基酸，但含硫氨基酸（主要是胱、半胱和蛋氨酸）水解中会被氧化，生成多级氧化产物，难以测准，色氨酸则全部分解为NH3和CO2，而无法测定。‹基本程序‹过程控制基本程序称取含蛋白7.5~25mg的试样+10.00mL6mol/LHCl在液N2中冷冻,抽真空至≤7Pa(5×10-2mmHg),封管置110±1℃烘箱,水解22~24h冷却、混匀、开管、过滤取适量滤液60℃，真空蒸干加适量样品稀释液,使各氨基酸浓度达50~250nmol/mL混匀,离心或过滤取上清液,测定过程控制（1）‹酸解法（常规酸解与氧化酸解-酸解）‹样品粒度与称样量样品均一性谷物氨基酸测定标准：60目筛，30mg饲料氨基酸测定标准：40目筛，100mg‹氨基酸标准的0.3-2倍（预先测定粗蛋白含量）。‹对于粗脂肪含量≥5%的样品需先脱脂。过程控制（2）酸解剂(浓度，添加苯酚）酸样比（可在40倍范围内变化）欧洲：10mgN：20/500ml北美：10mg蛋白：2/40ml水解方式：真空（充N）封管/回流水解水解温度与时间110℃-22h，135℃-4h，165℃-1h去酸方式氧化酸解‹原理:样品用过甲酸处理使蛋白质中的胱氨酸和蛋氨酸分别氧化为磺基丙氨酸和蛋氨酸砜,然后酸解,打开肽键形成单一氨基酸的混合液,用色谱分离、测定。‹基本程序‹过程控制基本程序含蛋白7.5～25mg的样品＋2mL过甲酸,0℃氧化16h+终止剂+HBr0.3mL,静置15min低于60℃下真空浓缩至干+6mol/LHCl10mL,110℃水解以下操作同酸解+33.6%偏重亚硫酸钠溶液0.5mL+7.5mol/LHCl15mL110℃,回流水解调pH,定容至50mL,过滤,上机过程控制‹过甲酸用量10mgN：0.3-33ml；7.5-25mgN：2-10ml‹冷氧化(0℃-16h)与热氧化(55℃-15min)‹不同终止剂HBr:Trp、Tyr、His、Phe偏重亚硫酸钠：Trp、Tyr‹酸解方式‹蒸干与调pH‹根据需要选择方法‹高盐样品（NaCL含量≥3％，3mg/mLAgNO3）色氨酸的测定‹基本程序50～100mg样品置聚四氟乙烯管中110±1℃水解20h＋1.5mL4mol/LLiOH,液N2冷冻,抽真空至≤7Pa(或充N2),封管冷却开管转移至25mL调pH至约4,用水定容离心或过滤,上机过程控制‹碱解剂NaOH、LiOH、Ba(OH)2KOH‹水解时间‹是否用内标‹不同测定方法比色法离子交换色谱HPLC—UV、Fluro游离氨基酸的测定‹饲料、食品中添加的游离合成氨基酸的测定‹氨基酸肥料当中的游离氨基酸的测定‹生物材料中游离氨基酸的测定动、植物组织中的游离氨基酸的测定--提取与除去蛋白生理体液中游离氨基酸—沉淀蛋白尿中的游离氨基酸游离氨基酸的测定当中的问题‹这些样品无需水解，但必须从固体样品中完全提取出来‹除去干扰测定的其他物质（蛋白、金属离子）去除蛋白方法：化学沉淀法、高速离心法、超滤法和离子交换法去除金属离子方法：化学沉淀法（EDTA）蛋白沉淀剂的选择‹蛋白沉淀剂的选择：应用较多的有苦味酸、磺基水杨酸（SAA）、三氯乙酸、乙醇等，Ohara曾比较上述沉淀剂和丙酮、硫酸锌、氢氧化钡、钨酸钠等九种沉淀剂的测定效果，证明苦味酸、SAA和乙醇效果最好。随着柱前衍生HPLC法的应用，甲、乙醇沉淀、高速离心和超滤法以及这些方法的结合日趋广泛：Davey等用PITC/HPLC测定生理体液，认为血浆、羊水用乙腈做沉淀剂最适宜，脑脊髓液用超滤法最佳。农业研究中，植物的根、茎、籽实、浆液常用80%的乙醇沉淀蛋白。游离氨基酸的提取‹用0.02mol/L浓度的酸反复提取，然后过滤或离心，汇集上清至预定体积；‹用0.1mol/L浓度的酸提取一次，...