应用!"#分子进行真菌分类的原理及方法谢艺贤郑服丛（中国热带农业科学院植物保护研究所海南儋州57l737）摘要系统介绍现代分子生物技术RFLPS，PCR，RAPDS，ALFPS和SAPS技术在真菌分类上的价值以及在某些方面已取得的成就，并详细介绍其分类原理和操作方法。关键词DNA分子真菌分类原理和方法真菌的亲缘关系或系统性的研究是建立生物资源预期价值信息存取系统不可缺少的内容。真菌分类学也是进行真菌遗传学、种群学以及流行病学研究的基础。近两个世纪以来，真菌分类一直是以形态学为主，主要分类依据：（l）性征（或交配型）；（2）性器官的形态，包括性器官的大小、形状、壁的厚度；（3）无性世代的形态，包括分生孢子的形态、孢子梗的长度、乳突、菌丝的肿大体等；（4）致病性，不同的种类侵染的对象和部位不一样，侵染方式不同。近几年来，随着生理生化特性遗传变异特点、血清学反应、酶学、分子生物学技术以及计算机技术等新的分类依据不断地被引入微生物学分类当中，真菌分类技术又增添了新的内容，分类依据也有所扩充：（l）血清学。血清学的方法已被广泛应用于真菌的研究［l］。其中，免疫荧光法是近几十年来发展起来的一门较先进的技术，它具有免疫学特异性和敏感性，又能在显微镜下清晰地看到染色体对象的形体特征，从而显著地提高了结果判断的可靠性。（2）菌丝可溶性蛋白质凝胶电泳。蛋白质电泳对解决疑难种的鉴定、异名的处理等分类学问题是较为简单易行的方法，在解决什么是种内形态变异和什么是种间性状交叉问题时成为一个很重要的依据［2］。（3）同功酶。同功酶作为一类蛋白质，其结构是由基因决定的。同功酶结构反映了生物间的亲缘关系，因此酶谱分析可应用于种和种下的分类［3］。随着分子生物学的发展，新的分子生物学技术的应用更新了系统学的研究。核酸分析可用来区分物种和评价亲缘系统发生的关系。DNA作为遗传物质要比表型特征更为真实地反应真菌的系统发育。核酸分析是在真菌学的系统发育和群体研究方面迅速发展起来的新技术。核酸的碱基组成（GC值）已经成为细菌分类学有价值的工具，并已列为分类群的属性。真菌的GC值有一个与细菌相似的范围。从GC值来看，真菌的进化是由GC值递增表现出来的［4］。另外DNA的含量也存在差异。用分子杂交的方法可以找到DNA的同源序列。两种生物之间的亲缘关系越近，它第6卷第l期华南热带农业大学学报2000年3月Vol.6No.lJOURNALOFSOUTHCHINAUNIVERSITYOFTROPICALAGRICULTUREMar.2000们之间所共有的多核苷酸的相同序列就越多，即同源百分率越高。DNA同源序列用于区分一般形态学方法不易鉴定的真菌种类是有价值的。不但能区分不同的种类，还可以进一步找出其亲缘关系［5］。DNA-RNA杂交的研究与DNA-DNA重组相比较，给基因组中已知类群RNA的顺反子计算提供了可能，这样的研究也为分类学和系统发育的分析提供了一个很好的工具［4］。生物的遗传与变异推动了生物的进化。作为遗传物质的DNA的序列直接决定了生物的种类。因此，用DNA分子对真菌进行分类能更准确更直接地反映真菌的系统发育。目前常用的DNA分子进行真菌分类的方法有：RFLP、PCR、RAPD、AFLP、SAP等几种方法。下面就对其原理和方法作简要阐述。1RFLPs-（restrictionfragmentlengthpolymorphisms）DNA的限制性片段长度多态性（RFLP）研究是在种、种内以及种群水平上进行分类研究的有效手段［6］。其基本原理是不同种、种内以及种群的DNA序列在进化过程中发生突变，造成限制性切点间的插入缺失重排或点突变。因此，当用某一限制性内切酶消化DNA时将产生不同长度的DNA片段。但由于通过电泳无法直接观察到结果，因此需寻找一个合适的探针（用同位素标记，或生物素、地高辛标记）来进行杂交，然后才可以观察到结果。其基本操作方法见图l：样品提取基因组!DNA!!用限制性酶酶解琼脂糖凝胶电泳DNA!变性将DNA"####转移到固相支撑物预杂交杂交洗膜放射自显影$用32P标记DNA探针图1RFLP分析流程图通过借助计算机处理大量的数据材料可以对DNA样品进行有效的分析，从而对样品的分类提供直接的依据。2PCR和RAPDs-（polymerasechainreaction，randomamplifiedpolymorplisms）多聚酶链式...
