PScgpd1启动子融合GUS基因在酿酒酵母中的瞬时表达_王俊杰VIP专享VIP免费

第27卷第5期2008年9月食品与生物技术学报JournalofFoodScienceandBiotechnologyVol.27No.5Sep.2008文章编号:1673-1689(2008)05-0027-06收稿日期:2007-07-25.基金项目:国家自然科学基金项目(30570142,20676053);国家863计划项目(2006AA020103);江苏省青年科技创新人才基金项目(BK2006504);长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0532).作者简介:王俊杰(1983-),男,湖北武汉人,微生物学硕士研究生.*通讯作者:饶志明(1975-),男,江西临川人,农学博士,教授,硕士生导师.主要从事工业微生物育种及分子生物学改造方面的研究.Email:raozm@yahoo.com.cnPScgpd1启动子融合GUS基因在酿酒酵母中的瞬时表达王俊杰1,2,饶志明*1,2,沈微1,2,方慧英1,2,诸葛健1,2(1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;2.江南大学生物工程学院,江苏无锡214122)摘要:利用PCR技术从酿酒酵母基因组克隆得到甘油代谢关键酶基因gpd1启动子,并成功构建真核生物穿梭表达载体pYX212-zoecin-PScgpd1-GUS,并将其电击转入酿酒酵母中。将构建成功的酿酒酵母Saccharomycescerevisiae基因工程菌分别在012,015,110mol/LNaCl的盐胁迫下培养,首次通过GUS组织化学染色法和荧光法测定GUS报告基因的瞬时表达酶活检测gpd1启动子的酶活表达。研究发现,酵母甘油代谢关键酶基因gpd1启动子在不同渗透压下的表达有明显的差异。证实了gpd1启动子是受渗透压调节的,属于诱导型启动子,这可能与渗透压胁迫下的甘油代谢密切关联,相关研究未见报道。关键词:甘油代谢;gpd1启动子;B-葡糖苷酸酶中图分类号:Q939.97文献标识码:AAnalysisofPromotergpd1oftheKeyGeneofGlycerolMetabolicinSaccharomycescerevisiaatDifferentOsmoticStressWANGJun-jie1,2,RAOZh-iming*1,2,SHENWei1,2,FANGHu-iying1,2,ZHUGEJian1,2(1.KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China;2.SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)Abstract:AshuttlevectorpYX212-zeocin-PScgpd1-GUShadbeenconstructedandtransformedintoSaccharomycescerevisiaebyelectroporation.Thetransformantswasculturedinmediumwith012,015and110mol/LNaClsupplement,respectively.Theenzymeactivityofpromotergpd1wasdeterminedbytransienthistochemicalanalysisofGUSgeneatdifferentosmoticpressure.Theresultshowedthattheexpressionofpromotergpd1inS.cerevisiaeatdifferentosmoticpressurewereprominentlydifferent.Itwasconcludedthatthepromotergpd1wasaninduciblepromoter,regulatedbyosmoticpressure.Keywords:glycerolmetabolic;promotergpd1;GUS甘油(glycerol)是甘油三酸酯分子的骨架成分;它具有相对分子量小、容易溶解,在生理pH值范围内不带净电荷,能被细胞膜保持住,对生物细胞无任何毒副作用等特点,因此被认为是一种极其理想的耐高渗透压介质。在真核生物中,存在于胞浆中的3-磷酸甘油脱氢酶,以NAD+为辅酶,催化磷酸二羟丙酮生成3-磷酸甘油,然后3-磷酸甘油磷酸酶催化3-磷酸甘油生成甘油。当环境渗透压升高时,酿酒酵母将合成并在胞内积累甘油以维持细胞内外的渗透压平衡[1],但是其分子内部作用机理尚未研究清楚。经研究发现[2-4],3-磷酸甘油脱氢酶(GPDH)至少有两个同工酶,分别为gpd1、gpd2,且生物体内甘油合成代谢中以gpd1为主;GPDH作为生物体内甘油合成代谢途径中的限速酶,直接决定了葡萄糖分解代谢过程中向甘油合成方向的物质流分配量和甘油合成水平[5]。赵有玺等[6]克隆到产甘油假丝酵母产甘油关键酶基因gpd1,并将其在酿酒酵母中表达,发现甘油合成量有显著的提高;陈献忠等[7]从一株产甘油假丝酵母的工业菌种中成功克隆到GPDH的编码基因Cggpd的上下游序列,在一定的盐胁迫下将该基因在其它的酵母中异源表达,发现携带Cggpd基因的转基因酵母比野生型的酵母有明显的耐渗透压胁迫的能力。但是,甘油含量的提高与GPD基因内部的之间的作用机理也未研究透彻,且gpd1基因的启动子与甘油含量的积累之间的研究未见报道。利用基因融合来研究现代分子生物学的问题,如基因表达、调控等是非常有效的,GUS(B-葡糖苷酸酶)基因...