转基因集胞藻PCC6803培养条件的优化�张晓青,张学成��,臧晓南(中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003)摘�要:�通过研究培养基中硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐等单因子对转牙鲆生长激素基因的集胞藻PCC6803生长的影响,再对以上3营养因子进行三水平的正交实验,得到培养基中硝酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐的优化组合。还对培养温度、光照强度、pH值进行三因素三水平的正交实验,以确定最适的培养条件。实验结果表明,转基因集胞藻PCC6803在30�,光照强度3000lx,pH值8培养条件下,培养基中NaNO31.25g/L,K2HPO40.04g/L,Na2CO30.03g/L(其它同BG�11培养基),藻细胞的生物量得到有效提高,特定生长速率达到20.64,这为转牙鲆生长激素基因集胞藻PCC6803进一步高密度放大培养提供了依据。关键词:�转基因集胞藻PCC6803;正交试验设计;优化;培养条件中图法分类号:�Q78;Q949.22�����文献标识码:�A�����文章编号:�1672�5174(2007)06�115�06��随着藻类基因工程的发展,转基因蓝藻已有可能被大规模应用于植物疫苗生产、环保及高附加值产品的生产等。作为转基因蓝藻大规模应用必然涉及的蓝藻的高密度培养技术研究也会日益引起人们关注。单细胞蓝藻集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803是藻类基因工程中常用的宿主系统[1]。早在1970年,科学家们发现集胞藻6803可以融合外源DNA,通过同源重组把外源DNA整合到染色体DNA上[2]。1996年,集胞藻6803的全基因组测序工作已经完成[3],这为该物种基因工程的发展奠定了重要基础。Williams已经将卡那霉素抗性基因转入到集胞藻6803中表达[4];吴桂芳获得了能在红霉素抗性培养基上正常生长的agp基因缺失突变株[5];宋凌云在集胞藻6803中表达人肝金属硫蛋白突变体��基因[6];孔任秋等利用随机片段进行同源重组,可以在短时间内找到某些重要的功能基因[7],集胞藻6803已成为藻类基因工程研究中常用的表达系统。鱼类生长激素(GH)是由鱼的脑垂体前叶细胞合成分泌的1种单链多肽类激素,具有促进鱼体生长发育、调节蛋白质合成和脂肪代谢等生理功能,而且还能提高饵料转化效率[8]。研究证实,基因工程方法获得的生长激素具有代偿内源生长激素的功能[9]。牙鲆(Paralichthysolivaceus)是1种底栖肉食性的经济鱼类,是我国重要的海水养殖鱼类。牙鲆成熟的生长素是迄今发现的最小的生长素,含有171~173个氨基酸残基,分子量为19.4~19.7kD[10]。臧晓南等将牙鲆生长激素基因转入集胞藻PCC6803中并得到表达,其表达量为223ngGH/1mg[11]。成功构建转基因藻之后,实现高密度培养是转基因集胞藻能否走向应用的关键环节之一。集胞藻6803主要通过光合自养进行生长,影响集胞藻光合自养的主要因素包括培养基的氮、磷、碳酸盐浓度,光照强度、温度、培养基的pH值等。王淑等研究认为培养基中的氮源、碳源浓度、及光照强度对转小鼠硫蛋白基因集胞藻6803及野生型藻的生长有很大的影响[12]。Woldman研究认为温度、光照是影响微藻生长繁殖、生物量积累以及次生物质代谢的重要条件[13]。汪琨等研究证实转基因聚球藻PCC7942通过培养温度、光照强度、pH值和培养基中碳、氮源的浓度优化,能极大提高藻细胞的生物量[14]。由此可见,单独研究氮源、Na2CO3浓度或生态因子对微藻生长影响较多,但氮、磷、碳酸盐浓度,以及在营养盐优化的基础上研究生态因子对转基因微藻生长研究却很少。本文通过对培养温度、光照强度、pH值,以及氮、磷、碳酸盐浓度等参数进行研究和优化,为转牙鲆生长激素基因集胞藻6803生长提供优化的生长条件,提高转基因集胞藻PCC6803的生长速率,以期达到高产低成本的目的。本文为转基因藻大规模培养提供理论指导和优化工艺,对促进转基因藻的实用化具有重要的意义。1�材料与方法1.1材料1.1.1藻种��转基因集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803由中国海洋大学藻类遗传实验室构建[11]。1.1.2培养基��基本培养采用含有卡那霉素50�g/mL的BG�11[15]培养基(g/L):NaNO31.5,K2HPO4���作者简介:张晓青,(1983�),女,硕士生。E�mail:xczhang@ouc.edu.cn基金项目:国家高技术研究发展规划项目(819�04�10);农业转基因生物安全管理办公室批准项目(2005�T104)资助收稿日期:2007�06�20;修订日期:2007�11�16...
