第四章实验结果1病原分离鉴定实验1.1PCR结果参照已有的鸭坦布苏病毒检测方法对收集的鸡胚尿囊液进行PCR检测，PCR扩增产物送生物技术公司测序。结果显示，FC1-FC4及YF2样品接种的鸡胚尿囊液中均未检测到禽坦布苏病毒核酸，YF1，YF3和YF4样品接种的鸡胚尿囊液中检测到DTMUV的存在。PCR扩增片段经测序表明与FJMH220株、YY5株及BYD-1株的同源性在99.1%。因YF1，YF3和YF4样品都来源于同一鸭场的同一批鸭，由此将3份样品分离获得的病毒视为同一株病毒，命名为YF株。获得的病毒经蚀斑纯化后，-80℃保存备用。通过RT-PCR扩增出病毒YF株基因组的8个基因片段，琼脂凝胶电泳检测，片段大小与预测基本相符，结果见图1。扩增片段经1%琼脂凝胶纯化回收后，克隆到pEASY-B载体中，随后每个片段挑选3个阳性克隆送生物技术公司测序。图1病毒YF株基因组的扩增M、DNA分子量标尺；1-8、YF毒株基因组各扩增片段1.2序列比对结果序列分析表明，该株病毒全基因组全长10990nt，未出现核苷酸插入或缺失及基因重组的变异情况，与已报道的DTMUV分离株的核苷酸同源性均在98.5%以上，且亲缘关系与当前鸭群中优势病毒亚群非常近。表3坦布苏病毒信息及序列同源性比对结果毒株GenBankID宿主YF株(%)毒株GenBankID宿主YF株(%)核苷酸氨基酸核苷酸氨基酸XHZD/2010JQ595407鸭99.299.0JXSPJQ920423鸭99.599.7Shandong1JX965381鸭99.399.4Du/CH/LSD/110128KC136210鸭98.599.0FJMH220JQ928189鸭99.398.6ZJ-6JF459991鸭99.499.5ZJ-407JQ314464鸭99.399.0byd1JQ920420鸭99.499.2YY5JF270480鸭99.299.1TAJQ289550鸭99.399.4JSJQ920422鸭99.499.2WRJX196334鸭99.499.6JS804JF895923鹅99.398.7JX2JQ920426鸭98.599.2gooseJQ920424鹅99.499.6duanJQ920421鸭99.299.1ZJGH-2JQ314465鹅99.199.0JS/2010JX273153鸭99.499.1GS-PT-7JQ627864鹅99.499.8WJ-1JX549382鸭98.599.0SitiawanJX477686肉鸡87.296.2MM1775JX477685蚊虫88.696.4图2坦布苏病毒基因组分子进化分析GroupA为2010年后分离的坦布苏病毒；GroupB为2010年前分离的坦布苏病毒；黑三角(▲)标注的毒株为本实验分离的毒株；图中树结处的阿拉伯数字为自举检验置信值(1,000次重复)。图3基于病毒E蛋白（A）和NS5基因（B）的分子进化分析黑三角(▲)标注的毒株为本实验分离的毒株，图中树结处的阿拉伯数字为自举检验置信值(1,000次重AB复)以上果表明，在宜丰发病场采集的病料中分离到了鸭坦布苏病毒。鸭群中流行的鸭坦布苏病毒存在2个病毒群，但主要以II群的病毒为主，其中II-C亚群的毒株为流行的优势病毒群。本研究分离获得的江西分离株（YF株）基因组与已报道的高度同源，遗传稳定，没有出现核苷酸的缺失或插入，未发生基因重组现象。基于YF株全基因组的系统进化分析表明，YF株与鸭群中流行的II-C谱系病毒群亲缘关系最近，这与基于YF株病毒E蛋白及NS5蛋白编码基因的遗传进化分析结果一致，江西鸭群中流行的鸭坦布苏病毒遗传比较稳定，未发生变异。2病毒复制试验2.1临床结果A组蛋鸭前期出现绿色稀便，死前均表现精神沉郁、四肢无力、头颈歪斜、蜷缩于角落，出现产蛋极速下降情况。解剖死鸭发现，最明显的临床病理变化是卵黄溶解、卵巢萎缩钙化淤血，大部分有心冠淤血现象。B组、C组蛋鸭表现正常。2.2PCR检测结果A组病料通过RT-PCR扩增出病毒YF株的基因片段，琼脂凝胶电泳检测，片段大小与预测基本相符，结果显示，实验室经过病原分离鉴定，重新得到了鸭坦布苏病毒YF毒株。B组、C组蛋鸭未见YF基因扩增片段。通过以上实验能成功复制鸭坦布苏病毒病，表明鸭坦布苏病毒病不仅具有致病性且是独立的病毒种类，具有可复制性，且在感染机体内能够稳定存在。3病毒传播途径探究试验3.1临床结果通过试验发现通过接触传播、空气传播方式均能使鸭群感染鸭坦布苏病毒病，蛋鸭出现精神沉郁、采食下降、产蛋率急剧下降等临床状况。表4病毒传播途径产蛋率变化情况3.2病理剖检结果病理剖检结果：解剖死鸭发现，直接接触传播和空气传播感染蛋均出现鸭卵黄溶解、卵巢萎缩钙化淤血、部分死鸭出现心冠淤血等情况，空白对照组剖检正常，结果见图6。图6病毒传播途径试验蛋鸭病理组织学检查情况空气传播组混群接...
