临床检测样本RNA提取方法的比较研究分析 生物技术专业VIP免费

临床检测样本RNA提取方法的比较研究摘要：选择市售的三种细胞裂解液（LiaisonPlus、TrollPlus和RNAOUT）和两种DNA\RNA共提试剂盒（柱式病毒DHARNA双提试剂盒、Queasy快速DNA/RNA共提试剂盒），分别对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和乙型脑炎病毒（JEV）三种病毒RNA进行提取，通过琼脂糖凝胶电泳和Real-timePCR间接评价所提取的RNA质量。结果表明：对于琼脂糖凝胶电泳，上述三种细胞裂解液和Queasy快速DNA/RNA共提试剂盒对应的组均可见清晰且高亮的条带，可用于临床RNA病毒检测以及定性分析。对于Real-timePCR，Queasy快速DNA/RNA共提试剂盒CT值最低，LiaisonPlus、TrollPlus两种细胞裂解液其次，以上三种试剂可用于临床RNA病毒检测以及定量分析。关键词：RNA；提取方法；比较；临床ComparisonofMethodsofclinicaltestsamplesRNAextractionAbstract：Threecommerciallyavailablecellsates(LiaisonPlus,TrollPlusandRNAOUT)andtwoDNA/RNAco-kits(ALCMENAdouble-kit,QueasyrapidDNA/RNAco-kit)wereselectedtoextractthreeanimalRNAviruses（PRRSV,CSFVandJEV）.TheRNAqualitywasevaluatedindirectlybyagaricgelelectroplateandReal-timePCR.Theresultshows,foragaricgelelectroplate,theclearlyandhighlightbandscanbeseenabovethegroupsofthethreecellsatesandQueasyrapidDNA/RNAco-kit,whichcanbeusedforclinicalRNAvirusdetectionandqualitativeanalysis.ForReal-timePCR,theCTvalueoftheQueasyrapidDNA/RNAco-kitgroupisthelowest,andthetwocellsatesgroups(LiaisonPlus,TrollPlus)followed.TheabovethreereagentscanbeusedforclinicalRNAvirusdetectionandquantitativeanalysis.Keywords:RNA；ExtractionMethod；Comparison；ClinicalRNA是生物体重要的遗传物质[1]。近年来，越来越多的科研结果表明，RNA在生命进程中的作用远不止于此，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNA名列榜首。RNA分子提取是生物学研究中的一项基本内容，是进行基因表达分析的基础[2]。对于DNA文库构建、荧光定量PCR、CRT、Northern杂交等下游分子生物学实验来说，都需要质量好的，完整性高的RNA[3]。在所有RNA试验中最关键的因素是分离得到全长RNA。分离出纯度高且完整的RNA是进行基因表达分析及RNA结构功能研究的基础。在所有RNA实验中，最关键的步骤是分离得到纯度高且完整的RNA。，从组织细胞中分离纯粹完整的RNA对于分子克隆和基因表达分析等试验是至关重要的[4,5]Chomsky和Sacchi第一次提出了用异硫氰酸胍法提取细胞内的RNA[6]，使得RNA的提取过程变得简便快捷。常见的RNA提取方法有强变性剂法[7]、CTAB法[8]、ADS-Phenol法[9]以及热硼酸法[10]等。在商品化的今天，国内外生物试剂公司研发出了许多RNA提取试剂盒。比如Tamara公司的LiaisonPlus；Inviting公司的Tripoli总RNA提取试剂盒以及PureLink™RNAMiniKit；上海生工的UNlQ-10柱式Tripoli总RNA抽提试剂盒；Omega公司的RNA小量提取试剂盒（BacteriaRNAkit）以及高纯RNA抽提试剂盒（HPtotalRNAkit）；Engage公司的RNeasyProtectBacteriaMiniandMidiKits等。都可以从病料组织或者培养细胞中快速有效地提取出高质量高纯度的RNA。实时荧光定量PCR的原理是以荧光共振能量转移原理为基础[11,12]。荧光共振能量转移原理是当一个荧光分子（供体分子）的荧光光谱与另一个荧光分子（受体分子）的激发光谱重叠时，供体荧光分子自身的荧光强度衰减，受体荧光分子的荧光强度增强。Ct值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。Ct值是实时荧光PCR中一个很关键的因素，C代表循环（Cycle），t代表阈值（Threshold）。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线[13-15]。因此，根据荧光探针的发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的数量呈对应关系，只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。与普通PCR相比，实时荧光定量PCR可以利用荧光信号实时监测PCR反应过程中每一个循...