MTTassayVIP专享VIP免费

MTT assay [预习用] 用途： 1.MTT assay is laboratory test and standard colorimetric assay. 2.for measuring the activity of enzymes that reduce MTT to formazan(甲臜). 3.can also be used to determine cytotoxicity of potential medicinal agents. 原理： 1.Yellow MTT（黄色染料）is reduced to Purple formazan in living cells. (活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。) 2.甲瓒不溶于水，但能溶于一些增容溶剂(solubilization solution)，如DMSO。 3.DMSO is added to dissolve the formazan into a colored solution 4.the absorbance of the colored solution can be quantified. 5.the wavelength of the absorbance is usually between 500 and 600 nm. (570nm/490nm in 酶标仪) 6.通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD 值推测出活细胞的数目。 MTT 溶液配制方法： 1.通常MTT 的浓度为5mg/ml。 可以称取MTT 0.5 克，溶于100 ml 的PBS(or 无酚红的培养基)中 2.用0.22μm 滤膜过滤以除菌 3.4℃ 避光保存即可。 NOTE： 1.在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。往 96 孔板加时可以不避光，也可以把操作台上的照明灯关掉。 2.MTT 最好现用现配. 过滤后 4℃避光保存两周内有效;或配制成5mg/ml 保存在-20 度长期保存 3.避免反复冻融，最好小剂量分装 4.当 MTT 变为灰绿色时绝对不能再用 5.MTT 有致癌性 6.MTT 对细菌敏感 PBS 配方： Nacl 8g/Kcl 0.2g/Na2HPO4 1.44g/KH2PO4 0.24g 调 pH 7.4、定容1L （可定容后测pH 约 7 即可） 实验方法：（用于贴壁细胞） 1.对数期细胞，调整细胞浓度，（每孔加入100ul,使待测细胞调密度至1000-10000 孔），边缘孔用无菌PBS 填充。 2.在5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底。 3.加入浓度梯度的药物 （原则上，细胞贴壁后即可加药，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药。） （一般 5-7 个梯度，每孔100ul，设 5 个复孔，否则难以反应真实情况） 4.在5%CO2，37℃孵育 16-48 小时，倒置显微镜下观察。 5.每孔加入20ulMTT 溶液（5mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养 4h。 （若药物与 MTT 能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS 冲 2-3 遍后，再...