I中 文 摘 要过氧化物酶(peroxidase,POD,EC 1.11.1.7)是一类广泛存在于生物中的氧化还原酶。天然过氧化物酶的血红素基团通常是铁原卟啉 IX,其包含四个与Fe(III)相连的吡咯环。H2O2可以与过氧化物酶活性中心血红素相互作用,将过氧化物酶活化为反应中间体,介导氧化还原反应。III 类过氧化物酶-过氧化氢酶超家族是来源于植物的分泌型过氧化物酶,在胞质中合成后可以转运至细胞壁或液泡,参与多种植物生理功能,如机体内毒性过氧化物的清除、细胞壁的合成、伤口愈合、生长素合成及代谢等。蛋白磷酸酶是一类将磷酸化的物质脱去磷酸基团,从而使物质去磷酸化。蛋白磷酸酶与蛋白激酶的作用相辅相成、缺一不可,在生物的生命活动,如细胞分裂、信号传导、RNA 剪接、DNA 修复、原癌基因和抑癌基因的表达等过程中,发挥着不可替代的作用。黍子过氧化物酶(proso millet peroxidase, PmPOD)是一种来源于黍子中的含血红素辅基的阳离子过氧化物酶。PmPOD 不仅具有依赖于血红素辅基的过氧化物酶活性,同时也具有不依赖于血红素辅基的磷酸酶活性。在体外,PmPOD 可以将DNA 磷酸二酯键断裂或将 dNMPs 磷酸酯键断裂,脱去磷酸基团,而 Mg2+的存在有利于 PmPOD 磷酸酶活性的发挥。但是,对于 Mg2+增强 PmPOD 磷酸酶活性的机制和 PmPOD 发挥磷酸酶的活性位点尚不清楚。因此,本论文将从以下三方面进行研究:1、采用紫外-可见分光光谱法,荧光光谱法和高效液相色谱,研究了以 dNMPs为底物,Mg2+对 PmPOD 磷酸酶活性的影响,并对其反应机理进行了初步的探究。结果表明:Mg2+介导了 PmPOD 与底物的相互作用,但 Mg2+并未直接与 PmPOD 发生作用。在 Mg2+存在的情况下,dNMPs 对 PmPOD 内源荧光淬灭方式发生变化,由动态淬灭转变为静态淬灭,结合常数大小依次为:KadCMP > KadGMP > KadTMP > KadAMP。另外,Mg2+也可以增强 PmPOD 水解 dNMPs 的速率 3~13 倍,且水解速率 VdCMP > VdGMP > VdTMP > VdAMP,与结合常数的变化一致。因此,我们得出结论,PmPOD 发挥磷酸酶活性与其发挥过氧化物酶的活性位点不同,Mg2+与 dNMPs 首先形成复合物,增大了底物 dNMPs 与 PmPOD 结合,进而加速了 PmPOD 对 dNMPs 的水解;2、将 PmPOD 中包含预测的磷酸酶活性位点的片段(147-296 aa)所对应的基因序列构建到表达载体 pET-32a 上,进行原核重组表达。通过亲和纯化层析、复性以及质粒切割实验等过程,...