I中 文 摘 要过氧化物酶（peroxidase，POD，EC 1.11.1.7）是一类广泛存在于生物中的氧化还原酶。天然过氧化物酶的血红素基团通常是铁原卟啉 IX，其包含四个与Fe（III）相连的吡咯环。H2O2可以与过氧化物酶活性中心血红素相互作用，将过氧化物酶活化为反应中间体，介导氧化还原反应。III 类过氧化物酶-过氧化氢酶超家族是来源于植物的分泌型过氧化物酶，在胞质中合成后可以转运至细胞壁或液泡，参与多种植物生理功能，如机体内毒性过氧化物的清除、细胞壁的合成、伤口愈合、生长素合成及代谢等。蛋白磷酸酶是一类将磷酸化的物质脱去磷酸基团，从而使物质去磷酸化。蛋白磷酸酶与蛋白激酶的作用相辅相成、缺一不可，在生物的生命活动，如细胞分裂、信号传导、RNA 剪接、DNA 修复、原癌基因和抑癌基因的表达等过程中，发挥着不可替代的作用。黍子过氧化物酶（proso millet peroxidase, PmPOD）是一种来源于黍子中的含血红素辅基的阳离子过氧化物酶。PmPOD 不仅具有依赖于血红素辅基的过氧化物酶活性，同时也具有不依赖于血红素辅基的磷酸酶活性。在体外，PmPOD 可以将DNA 磷酸二酯键断裂或将 dNMPs 磷酸酯键断裂，脱去磷酸基团，而 Mg2+的存在有利于 PmPOD 磷酸酶活性的发挥。但是，对于 Mg2+增强 PmPOD 磷酸酶活性的机制和 PmPOD 发挥磷酸酶的活性位点尚不清楚。因此，本论文将从以下三方面进行研究：1、采用紫外-可见分光光谱法，荧光光谱法和高效液相色谱，研究了以 dNMPs为底物，Mg2+对 PmPOD 磷酸酶活性的影响，并对其反应机理进行了初步的探究。结果表明：Mg2+介导了 PmPOD 与底物的相互作用，但 Mg2+并未直接与 PmPOD 发生作用。在 Mg2+存在的情况下，dNMPs 对 PmPOD 内源荧光淬灭方式发生变化，由动态淬灭转变为静态淬灭，结合常数大小依次为：KadCMP > KadGMP > KadTMP > KadAMP。另外，Mg2+也可以增强 PmPOD 水解 dNMPs 的速率 3~13 倍，且水解速率 VdCMP > VdGMP > VdTMP > VdAMP，与结合常数的变化一致。因此，我们得出结论，PmPOD 发挥磷酸酶活性与其发挥过氧化物酶的活性位点不同，Mg2+与 dNMPs 首先形成复合物，增大了底物 dNMPs 与 PmPOD 结合，进而加速了 PmPOD 对 dNMPs 的水解；2、将 PmPOD 中包含预测的磷酸酶活性位点的片段（147-296 aa）所对应的基因序列构建到表达载体 pET-32a 上，进行原核重组表达。通过亲和纯化层析、复性以及质粒切割实验等过程，...
