限制酶选择的三大依据1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类图 1 (1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶,以便将目的基因“切出”,如图甲可选择 Pst Ⅰ(目的基因两端均具Pst Ⅰ)。(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,以防破坏目的基因 ,如图甲不能选择SmaⅠ。(2)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒 ,如图甲也可选择用PstⅠ和 EcoRⅠ两种限制酶 (但要确保质粒上也有这两种酶的切点 ),而且这种切点不至于完全破坏“标记基因”。2.根据质粒的特点确定限制酶的种类(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致,以确保具有相同的黏性末端。(2)质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,应至少含有一个完好的标记基因,如图 2 中限制酶 pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标记基因而不宜选择。(3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点(如图 2 中 KpnⅠ)。如果所选酶的切点不止一个,则切割重组后可能会丢失某些片段—— 若丢失的片段含复制起点区 ,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。(4)所选限制酶 ,其切点应位于启动子与终止子之间,如图 2 中 HindⅢ会破坏启动子,EcoRⅠ会破坏终止子 ,而 Nde Ⅰ和 BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。3.参照 Ti 质粒的 T－DNA 片段选择限制酶若质粒上标出 T－DNA 片段 ,则所选限制酶切点应位于T－DNA 片段中 ,从而有利于将目的基因嵌入到T－DNA 片段上 —— 因为 Ti 质粒的 T－DNA 片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA 上,从而实现“转化”。如用两种限制酶 XbaⅠ和 SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某 DNA, 获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体,则甲～丁四种Ti 质粒中宜选择“丙”作载体 ,而不宜选择甲、乙、丁。 (分析如下 ) 1.(2016 ·全国卷 Ⅲ,40)图(a)中的三个 DNA 片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和 Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)为某种表达载体的示意图 (载体上的 EcoRⅠ、 Sau3AⅠ的切点是唯一的 )。根据基因工程的有关知识 ,回答下列问题 : (1)经 BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被酶切后的产物连接 ,理由是 ________________________________________________________ _____________________________________________...
