百度文库1 实验二双水相萃取α- 淀粉酶的分配平衡实验一、实验目的与要求1）掌握双水相萃取技术的基本原理和主要影响因素。2）了解目标产物的性质如等电点、电荷和分子量等。3）掌握熟悉聚乙二醇（PEG） / 硫酸铵体系双水相萃取实验操作。4）明确 PEG分子量、硫酸铵浓度、pH和添加 NaCl 等因素对α- 淀粉酶分配系数的影响。二、实验器材和试剂1.实验器材 : 低速离心机；酸度计；涡流混合器；分光光度计2.实验试剂 : PEG：（分子量分别为1000、2000、4000、6000、8000）、硫酸铵、α- 淀粉酶、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、考马斯亮蓝 G-250 三、实验原理双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛，最常采用的双水相体系是PEG/Dex或 PEG/低分子盐系统，其中低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。PEG/磷酸钾双水相体系相图如上所示。T 为上相浓度， B 为下相浓度 , C 为系统临界点，TCB为临界线或双节线，双节线以上为两相区、以下为一相区或均相区。因此两相浓度要足够高才可以形成两相。双水相萃取分配系数K=Ct/Cb，为上相和下相的浓度比。双水相系统分配系数的影响因素包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、 pH 等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、等电点和分子量等。利用双水相技术可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配。相图中TMB为系线，其长度由相组成的总浓度决定，表征两相差异程度。在临界点附近系线长度趋近于零，表示上相和下相的组成相同，因此分配系数应为1。随着PEG、硫酸铵和盐浓度增大，系线长度增加，上相和下相相对组成的差别就增加，酶在两相中的分配系数会受到极大的影响。本实验采用PEG/硫酸铵双水相体系研究α- 淀粉酶的分配，具体研究PEG分子量、硫酸铵浓度、pH和添加 NaCl 浓度对α- 淀粉酶分配系数的影响。参考：- 淀粉酶是广泛应用的生物酶类，B.Subtilis细菌α - 淀粉酶是研究和应用较多的α- 淀粉酶， 其分子量为48 KD，PI 约为 5，最适 pH5.3-6.4 ，在 pH4.8-8.5之间稳定。四、实验步骤1. PEG/ 硫酸铵双水相体系相图绘制（全班都做）百度文库2 配制40%PEG1000和 43%硫酸铵原液（没有混合前的液体，混合后浓度是相图中最终浓度），分别取0.7gPEG1000、2000、 4000、6000 原液（ PEG10002000、4000、6000 密度分别为1.037g/mL 、1.066 g/mL 、1.03 g/mL 、 1.07 ，因此加入0.7g 对...
