Western Blot 详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western 免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot 技术: 一、原理 二、 分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光 ECL ECF iv.底物DAB 呈色 三、 主要试剂 四、 主要步骤 五、 实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 5.Marker 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问 8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、 原理 与Southern 或Northern 杂交方法类似，但Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL 和底物DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只 要买 现成的试 剂 盒 就 行 ，操 作也比 较 简 单 ，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧 化物+鲁 米 诺 ，如遇 到 HRP，即 发光，可 使 胶片 曝 光，就 可 洗 出 条带 。 三、主要试剂 1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有 29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加 H2O 至 100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实 PH 不得超过 7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、 十二烷基硫酸钠 SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O 去离子水配制，室温保存。 3、 分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到 100ml 终...
