目录重组DNA技术RecombinantDNATechnology目录重组DNA技术的发展史1865年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1985年K.Mullis的聚合酶链式反应技术1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉目录第一节重组DNA技术概述OverviewofRecombinantDNATechnology目录一、重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）“克隆”就是获得遗传背景完全相同的分子或个体的“拷贝”目录技术水平：分子克隆(molecularcloning)即DNA克隆生殖性克隆(动物克隆)治疗性克隆DNA克隆(DNAcloning)通过一系列操作在体外获得大量相同DNA分子的技术，也称分子克隆(molecularcloning)或重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)。目录（二）分子(DNA)克隆可以产生大量相同的DNA分子利用分子克隆手段,可以获得大量相同的DNA分子,这主要基于DNA分子能构建到克隆载体中形成重组DNA分子,并在宿主细胞中复制,通过这种方式,重组DNA被扩增。目录二、重组DNA技术是在体外利用酶对DNA进行重组的操作重组DNA技术(recombinantDNAtechnology),即在体外利用酶学方法将感兴趣的物种来源的DNA片段转移到能自主复制的遗传元件(又称载体)中,形成重组的DNA分子,并在宿主细胞中增殖。这种复制基因或DNA片段以产生相同DNA分子“拷贝”的技术，称为重组DNA技术或DNA克隆。又称分子克隆、基因克隆、基因工程或遗传工程。目录以质粒为载体的DNA克隆过程目录目录第二节重组DNA技术常用分子工具MolecularToolsinRecombinantDNATechnology目录一、工具酶在重组DNA技术中具有特殊的用途限制性内切核酸酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性内切核酸酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目录目录（一）限制性内切核酸酶是重组DNA重要的工具酶定义:限制性内切核酸酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ目录作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属系株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶目录Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG目录BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口目录同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ目录同尾酶（isocaudarner）有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA目录（二）连接酶可将具有配伍...
