人民医院基因扩增实验室肺炎支原体核酸定量检测标准操作程序

人民医院基因扩增实验室肺炎支原体核酸定量检测标准操作程序项目名称肺炎支原体核酸定量检测检验方法名称TaqMan 荧光定量检测方法学原理用一对肺炎支原体特异性引物和一条肺炎支原体特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团(R)和一个荧光淬灭基团(Q)。探针完整时，R 基团发射的荧光信号被 Q 基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使 R 荧光基团和 Q 荧光基团分离，Q 基团对 R 基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到 R 基团的荧光信号。每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与 PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。因此根据 PCR 反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。标本要求4.1适用标本类型：痰液、咽拭子等。4.2标本采集（泌尿生殖道分泌物）a）痰液—使用一次性吸痰器，患儿取仰头平卧位，将吸痰管缓缓插入咽喉部，调节负压，将气管深部分泌物（在雾化吸入后效果较好）缓缓吸入储液瓶中，反复数次，储液瓶中分泌物即为标本，密封送检。a）咽拭子—用咽拭子取咽部分泌物（多数会有粘稠的痰液），将咽拭子置入无菌玻璃管，密封送检。4.3标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20°C 待测，保存期为 6 个月。试剂5.1试剂名称：肺炎支原体核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）5.2生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司；5.3试剂货号：#DA-B064；5.4包装规格：20 人份/盒；5.5试剂成份：组成部分数量DNA 提取液（500 卩 1/管）2 管MPPCR 反应液（400 卩 1/管）2 管Taq 酶（60 卩 1/管）1 管MP 阴性质控品（50 卩 1/管）1 管组成部分数量MP 强阳性质控品（50 卩 1/管）1 管MP 弱阳性质控品（50 卩 1/管）1 管MP 阳性定量参考品（1.0X105基因拷贝/ml）10 卩 1/管1 管MP 阳性定量参考品（1.0X106基因拷贝/ml）10^1/管1 管MP 阳性定量参考品（1.0X107基因拷贝/ml）10^1/管1 管MP 阳性定量参考品（1.0X108基因拷贝/ml）10^1/管1 管5.6 试剂储存条件：保存于一 20°C，有效期 6 个月。仪器ABI7500 全自动基因扩增检测仪操作步骤7.1DNA 提取7.1.1阴性质控品处理a）向阴性质控品管中加入等量 DNA 提取液充分混匀，100C 恒温处理 10±1 分钟；b）12000r/min 离心 5min,备用。7.1.2标本处理7.1.2.1 痰液a）痰液中加入 4 倍体积...