Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒上海优宁维生物科技有限公司一、概述 在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA 片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。AnnexinV 是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此 AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将 Annexin V 与 PI 匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 因此，将 Annexin V 与 PI 联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被 FITC 和 PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。 图 Annexin V 检测细胞凋亡原理二、试剂盒组份 产品编号产品名称规格556547Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I100testsComponents556547aAnnexin V Binding Buffer, 10X conc (51-66121E)556547bAnnexin V-FITC (51-65874X)三、实验步骤 贴壁细胞需用 0.25%的胰酶消化。注意过度消化可损伤细胞。在消化时可加 2％的 BSA 可防止消化过度。如果用含 EDTA 的胰酶消化时，注意必须彻底清除 EDTA：在标记前用 1×PBS 或 1×bindingbuffer 洗涤，清除 EDTA，以免残余的 EDTA 与 Ca2＋螯合，影响 Annexin V 的结合。（1）用去离子水将 10×Binding Buffer 稀释成 1×Binding Buffer；（2）细胞收集。悬浮细胞收集：离心 5 分钟；贴壁细胞：用不含 EDTA 的胰酶消化收集后（注：胰酶消化时间不宜过长，否则会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与 Annexin V-FITC 的结合），于室温 2000rpm 离心 5～10 分钟，收集细胞；（3）细胞洗涤：用预冷 1×PBS（4℃）重悬细胞一次，2000rpm 离心 5～10分钟，洗涤细胞；（4）加入 300μL 的 1×Binding Buffer 悬浮细胞；（5）Annexin V-FITC 标记：加入 5μL 的 Annexin V-FITC 混匀后，避光，室温孵育 15 分钟；（6）PI 标记：上机前 5 分钟再加入 5μL 的 PI 染色。（7）上机前，补加 ...
