1/11题目：目的基因双酶切和电泳纯化胶回收．实验目的:1.学习双酶切法获取目的基因片段的原理和方法2.练习 DNA 琼脂糖凝胶电泳的原理和方法。3.学习核酸琼脂糖胶回收的原理和方法。．实验原理1. 限制性核酸内切酶：生物体内能识别并切割特异的双链 DNA 序列的一种内切核酸酶。由于这种切割作用是在 DNA 分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。2. 切割序列：（1）BamHI 切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：5'…G；GATCC…3'f5'…GGATCC-3'3'…CCTAGfG…5'f3'…CCTAGG-5'（2）EcoRI 切割识别序列后产生两个互补的粘性末端：5'；AATTC^3'f5'…GAATTC^3'3'^CTTAAfG^5'f3'…CTTAAG•••5'3. 为什么要选择表达载体质粒 pET-28a?pET 原核表达质粒是最有效的原核表达系统之一。目的基因被2/11克隆到 pET 质粒载体上，受噬菌体 T7 强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的 T7RNA 聚合酶诱导。宿主菌带有受 lacUV5 控制的 T7RNA 聚合酶基因，可以通过IPTG 来启动表达。充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的 50％以上。4•限制性内切酶的选择：选择 BamHI、Notl 两个位点由于实验中须将质粒 PEGFP-N3 上所需的目的基因切下并连接到载体质粒 pET-28a 上，所以选择的限制酶需满足以下几个要求：一•选择两种在质粒 pEGFP-N3 和载体质粒 pET-28a 上都有酶切位点的限制性酶切酶，以保证切下的目的基因和载体质粒分别都有两个不同的末端，这样可以防止：（1）质粒和目的基因的自身环化；（2）质粒与质粒、目的基因与目的基因相互自身连接；（3）质粒与目的基因反向连接）二．两种限制性内切酶的酶切位点需满足：（1）不破坏目的基因；（2）在质粒 pEGFP-N3 和载体质粒 pET-28a 上都有且只有一个酶切位点；（3）在载体质粒上的切割位点距离尽量短些，并且不破坏载体质粒的启动子等关键序列。?EGFP卜'CAGATCMGAGCJM668666口加 I\BMIXciuIil\岬 201XmaIiatllSmaI图三、pEGFP-N3MCS 多酶切位点示意图3/11载体质粒 pET-28a 和质粒 pEGFP-N3 的酶切位点示意图:5.琼脂糖凝胶回收（1）在酶切的过程中，除产生我们所需要的目的片段外，还会产生一些小片段，这些小片段可能会与载体连接，从而产生干扰，去除这些小片段的最好方法就是进行琼脂糖凝胶电泳；（2）不同分子量的 DNA 片段在琼脂糖凝胶电泳中由于泳动速度不一样而分离，...
