摘要目的:解淀粉芽孢杆菌在自然环境中广泛分布,易于分离和培养,对人类和人类无毒无害。其代谢物丰富,具有广谱抗菌活性,抗逆性强,生长快,稳定性好,在植物病害的防治中具有多种有益作用,非常适合生物的大规模生产和应用。本研究基于实验室中先前的实验并使用现有的质粒 pKSV7,本研究尝试选择合适的反向筛选标记以使无痕基因操作成为可能,并为解淀粉芽孢杆菌C10 的遗传修饰提供强大的工具。方法:相关研究显示,在菌体内体外胸腺嘧啶类似物 5-FU 可以生成有毒物质5-dUMP,利用这一原理可以敲除解淀粉芽孢杆菌 C10 内的 upp 基因,之后获得 C10Δupp 这一突变菌株,基于这一底盘细胞可以进行自杀型基因敲除载体pKSU-ΔamyA 的构建,此载体内含有 upp 基因,并成功敲除了 C10 中的amyA 基因片段。结果:1. 构建的 pKSV7-Δupp 载体经酶切以及测序确认载体构建成功。在探索解淀粉芽孢杆菌 C10 的电转化条件后,确定通过 LB 培养基过夜培养的解淀粉芽孢杆菌 C10 在 LBS 培养基(每升水 0.5 M 山梨糖醇,10 克氯化钠,10 克胰蛋白胨和 5 克酵母提取物)中转接,同时添加 0.64%甘氨酸溶液,0.05%Tween 80(w/v)溶液,1.02%DL -苏氨酸溶液,32 ℃振荡培养至 OD600=0.9。重悬感受态细胞时用 MSG 缓冲液(0.5 M 山梨糖醇,0.5 M 甘露糖醇和 10%甘油)。电转化时预设电压为 2000V,电击时间为 5ms,电击后加 900 uL 复苏培养基(LB 培养基里加 0.5 M 山梨醇,0.38M 甘露醇),180rpm 32℃复苏 3h,涂布含 Cm 的 LB 平板。2. 经过对 upp 基因敲除菌株 C10Δupp 菌株和原始菌株 C10 进行了生长曲线测定,发现 upp 基因的缺失对菌株生长速率没有影响。以此为依据可以在解淀粉芽孢杆菌的遗传学改造过程中将 upp 基因作为菌株的反向筛选标记基因。3. 在 pKSV7 载体中移入 upp 基因,再一次将含有 upp 表达盒的反向筛选质粒 pKSU 通过接合转移导入解淀粉芽孢杆菌 C10Δupp。将重新导入 upp基因的突变菌株 C10Δupp(pKSU)和突变菌株 C10Δupp 在 0.35mM 的5-FU 的平板上涂布,在此平板上含有 upp 基因的突变菌株C10Δupp(pKSU)出现生长异常,这表明含有 upp 基因的菌株对 5-FU 具有较高的敏感度,这一现象也从侧面表明了在对解淀粉芽孢杆菌进行遗传学改造时,upp 基因可以作为一种反向标记基因。4. 构建敲除载体 pKSU-ΔamyA,经过电转化进入突变...