半乳糖苷酶基因工程菌的开发

北京理工大学珠海学院 16 届本科生毕业论文α-半乳糖苷酶基因工程菌的开发α-半乳糖苷酶基因工程菌的开发摘 要α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase,EC 3.2.1.22）, 是一种催化水解 α-D-半乳糖苷(如半乳糖寡糖、半乳糖甘露聚糖)非还原性末端 α-D-半乳糖苷键的酶。此酶在食品以及饲料方面大量运用。但是由于目前 α-半乳糖苷酶的生产水平较低，成本较高，满足不了工业应用上的需求，所以本论文旨在通过分子生物学技术构建高效表达 α-半乳糖苷酶基因工程菌，降低生产成本，为工业应用奠定基础。本论文调研了 AB、AC、AA、AZ 和 AF 五种不同来源的基因，并构建了 pPICzαA-AB、pPICzαA-AC、pPICzαA-AA、pPICzαA-AZ 和 pPICzαA-AF 五种 α-半乳糖苷酶重组表达质粒，通过筛选比较， AA 基因的酶活最高，50L 发酵罐酶活达到 912U/mL。后续在 AA 菌株的基础上，通过增加 AA 基因的拷贝数以及共表达 HAC1 分子伴侣蛋白两种方式继续提高 AA 菌株的酶表达能力，结果共表达分子伴侣的菌株酶活大幅提高，其发酵液酶活高达 4663U/mL，是 AA 菌株的 5.1 倍，也是目前公开报道的最高水平。本研究从 α-半乳糖苷酶高酶活基因筛选和蛋白高效表达策略两方面入手，构建了高效分泌表达 α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌，其发酵 161 小时的酶活达到 4663U/mL，是目前公开报道的最高水平，本研究工作为 α-半乳糖苷酶的工业化生产和应用奠定了基础。关键词：α-半乳糖苷酶；巴斯德毕赤酵母表达系统；基因筛选；蛋白高效表达北京理工大学珠海学院 16 届本科生毕业论文Development of α-galactosidase producing strainAbstractα-Galactosidase (EC 3.2.1.22), is one kind of enzyme that hydrolyze non-reducing terminal α-D- galactosidic bonds in α-D-galactoside. The enzyme is currently widely used in food and feed industry. However, due to the low production capacity and high cost of α-galactosidase, it cannot meet the needs of industrial applications. In order to reduce the producing cost,this research aims to construct engineered Pichia pastoris strain with high level secretory expression of α-galactosidase through molecular biology. In this research,five α-galactosidases (AB, A...