原核表达的详细步骤(9 页)Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。原核表达详细步骤PartⅠ 选择表达的目的基因一、 基因序列 1. 得到靶基因 DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序: ① 利用生物信息学在 NCBI 上 blast 同源基因，找到同源蛋白，再在 DNA 的ORF 中找到正确的读码。 ② 实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在 DNA 上找到正确的读码。 ③ 利用 mRNA 的特征，找到启动子，编码区，终止子。在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。 2. 注意事项： ① 区别 ORF 和 CDS→ORF 一般在 DNA 上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS 可以是 DNA 上的定义，也可以是 mRNA 上的定义，分为 complete CDS 和 partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS 读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS 的读码是相应的 AA ② 在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。 二、 抗原决定簇的预测 1、 原理： 蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由 6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，假如用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，假如用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。 2、 选择原则： （1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。 （2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。 （3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的 N 端及 C 端是很好的抗原决定簇区域。 3、选定抗原决定簇的步骤： （1）预测：如软件预测 DNAstar（Protean）预测，Dnaman。在线网站预测（ and ） （2）选定：接近 N、C 端；选取在此区间内，（Antigenic Index）Jameson-wolf 抗原决定簇选正分高处；（Hydrophilicity plot）Kyte-Doolittle 预测亲水性强的区域。同时符合以上 3 点的区域较好（命名为多肽片断 A）。 注：假如设计的多肽是跨膜蛋白，请尽量回避选择蛋白...
