心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴定

心肌 α 肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体的构建及鉴定 关键词】 心作者：潘国栋 黄永章， 郭凌郧， 唐俊明， 孔 霞， YANG Qinglin， 王家宁肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞 [摘 要] 目的： 构建并鉴定心肌 α 肌球蛋白重链启动子驱动的绿色荧光蛋白表达载体，该基因只在心肌中特异性表达。 方法： 设计 5’和 3’分别具有 SalI/HindⅢ酶切位点的 EGFP 引物，聚合酶链反应法从pLEGFP 质粒中扩增增强型绿色荧光蛋白的cDNA，插入 pGEM-T Easy 载体表达盒，构建 pGEM-EGFP，SalI/HindⅢ 双酶切后回收729 kb 片断，插入经相同酶切的含 kb 心肌特异性 α 肌球蛋白重链启动子的 pNC26质粒，构建 pMHC-EGFP。连接产物转化感受态 DH5α，选择克隆，PCR 扩增鉴定，重组质粒经 NotI 酶切，回收 kb MHC-EGFP 表达盒。分离培育小鼠心肌细胞与骨骼肌成肌细胞。MHC-EGFP 表达盒通过脂质体法分别转染心肌与骨骼肌成肌细胞。荧光显微镜观察转染细胞是否出现绿色荧光，以鉴定MHC-EGFP 表达盒是否具有表达特异性。结果： EGFP cDNA 正确插入 pNC26 质粒中αMHC 启动子 3’端。成功转染 MHC-EGFP 表达盒的心肌细胞出现绿色荧光，而转染的骨骼肌成肌细胞无荧光出现。结论： MHC-EGFP 表达盒具有心肌特异性表达特性，为进一步监测干细胞向心肌分化讨论奠定基础。 [关键词] 心肌特异性；肌球蛋白重链；启动子；增强型绿色荧光蛋白；干细胞 Abstract: Objective To construct and identify the cardiac -myosin heavy chain promoter (MHC) -driven enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression vector (pMHC-EGFP), which solely expresses EGFP in cardiomyocytes. Methods EGFP cDNA primers were synthesized with forward primer and reverse primer containing SalI and HindⅢ, respectively. EGFP cDNA was amplified by polymerase chain reaction (PCR), added single deoxyadenosine at 3’ ends, and subcloned into pGEM-T easy vector to construct pGEM-EGFP. The fragment of 729 bp from SalI/HindⅢ-digested pGEM-EGFP was subcloned into pNC26, a plasmid carried kb MHC promoter, to construct pMHC-EGFP. The expression cass...