双向电泳操作步骤及相关试剂配制A． 实验过程一、实验原理：2-DE 的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向 SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。二、实验步骤：1.样品的溶解取纯化后的晶体蛋白 3.0mg，加入 300μl 裂解液(1mg 蛋白:100μl 裂解液)振荡器上振荡10min 左右，共处理一个小时。其中每隔 10～15 分钟振荡一次，然后 13200rpm 离心15min 除杂质，取上清分装，每管 70μl，—80℃保存。2.Bradford 法测蛋白含量取 0.001g BSA（牛血清白蛋白）用 1ml 超纯水溶解,测定 BSA 标准曲线及样品蛋白含量。取 7 个 10ml 的离心管，首先在 5 个离心管中按次序加入 0μl,5μl,10μl,15μl,20μl 的 BSA 溶解液，另 2 管中分别加入 2μl 的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水（总体积为 80μl），然后，各管中分别加入 4ml 的 Bradford 液（原来配好的 Bradford 液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用），摇匀，2min 在 595nm 下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度 BSA 的 OD 值，再测样品 OD 值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如：编号蛋白量（ul）Buffer(ul)Bradford(ml) OD595 值1 0402540.02431040.06141540.09152040.116Bt4 2 78 4 0.079Bt4 4 76 4 转 Bt4 2 78 4 0.075转 Bt4 4 76 4 标准曲线方程式：Y= aX+b.其中 Y 为 OD 值，X 为蛋白含量。a、b 通过作图输入数据可知 相关系数通过输入数据，作图，软件分析可得OD 值测量过程：比色皿用 70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定 OD 值。3.双向电泳第一向---IEF（双向电泳中一律使用超纯水）3.1 水化液的制备称 取 2.0mg 的 DTT ， 用 700μl 水 化 液 储 液 溶 解 后 , 加 入 8μl 0.05% 的 溴 酚 兰 ，3.5μl（0.5%v/v）IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清。在含 300μg 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为 340μl，振荡器上振荡混合,13200rpm 离心 15min 除杂质，取上清。3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次 170μl,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels (18cm，...
