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1.4.1乳酸菌基因敲除原理概述年左右，科学家研究出了一种非常有意义的生物学技术，也就是基因敲除技术。它的技术原理是在特定的环境下，对指定的基因序列进行删除并修改染色体将细胞内所含的遗传信息改变。这项技术的开发使得细菌正常反应和吸收过程发生变化，减少了多余新陈代谢物质的生成和发酵成本浪费，在某种水平上增加了产物的生产效率。而且，其对于细菌结构的研究也有一定的帮助，如乳酸菌Error:Referencesourcenotfound。经典基因敲除技术是利用DNA同源重组原理。同源重组依赖于基因同源序列的结合，并且重组发生在DNA分子或分子内交换等价物之间。根据同源重组原理，通过酶切连接和PCR等方法合理构建不同结构的重组载体，然后通过电转化等手段导入宿主细胞，实现宿主染色体DNA序列的片段缺失、定点突变或插入突变等。乳酸菌中的同源重组是一个复杂的过程，通常分为四个阶段，即初始阶段、同源序列配对、同源片段交换和异源片段交换以及Holiday中间体的分离，其间需要RecA，RecBCD，RecF，RecR，RuvAB等重要蛋白质的参与Error:Referencesourcenotfound。此外，基于位点特异性重组，乳酸菌也可以进行敲除。敲除的原理是在重组酶的催化下，两条DNA链将在特定位点进行重组。根据特定位点的顺序和方向，重组后可能会出现三个结果：整合（integration），切除（excision），倒位（inversion）。位点特异性重组酶由两个主要家族，整合酶系和解离酶系组成。整合酶家族的两种代表性重组酶系统分别是Cre/loxP和FLP/FRT重组酶系统。在解离酶家族中，乳酸菌中常用的重组酶是乳酸菌噬菌体TP901-1整合酶，其特异性介导attP位点与attB位点之间的重组反应。1.4.2乳酸菌基因敲除策略（1）利用同源重组单交换双交换进行敲除单交换和双交换同源重组的主要条件是构建重组载体，并利用PCR扩增靶基因的上游和下游片段或不完整的靶基因，将其连接到敲除载体，然后将其转化到宿主细胞中。一次或两次同源重组敲除或破坏基因。在进行基因敲除的过程中，只发生一次同源重组，称为同源单交换。单交换方法简单易行，整个质粒载体在重组后失去靶基因整合到目标基因中使之失活。同源重组双重交换是两次同源重组的发生。基于单交换再次进行交换，有缺失突变和插入突变两种。删除突变是指原有目的基因片段发生缺失，插入突变是敲除基因后再插入一个新的基因到靶基因中，使基因失活。除了突变体之外，在同源双交换后也会产生回复突变以获得野生型菌株。同源重组单双重交换技术是一种传统的基因敲除方法，应用的历史比较久远，理论知识成熟，操作方法简单。许多学者还在研究乳酸菌同源整合载体的构建和鉴定Error:Referencesourcenotfound。但是，这种方法的工作量过大，敲除的效率也比较低，容易产生回复突变。该技术用于革兰氏阳性细菌的敲除效率较低。（2）位点特异性重组敲除近年来，位点特异性重组基因靶向技术已被广泛使用。重组酶和特异性识别位点组成了位点特异性重组系统。重组酶只识别催化特异性位点之间的重组，因此反应非常特异和保守。通常用于乳酸菌的位点特异性系统是Cre/loxP系统和TP901-1/att重组系统Error:Referencesourcenotfound。（2）线形转化敲除法线性转化敲除是将线性DNA转化入宿主细胞进行同源重组，是近年来基因敲除的热点方法之一。最著名的是大肠杆菌中常用的Red/ET重组系统。它主要使用λ噬菌体Red蛋白组合和Rec噬菌体诱导蛋白RecE和RecT。与同源双交换相比，这种方法需要的同源臂只有35-50bp，重组效率更高。但是，它主要是应用于革兰氏阴性菌，鲜少有人报道过该系统在乳酸菌中的应用。目前，在乳酸菌中应用的线性敲除技术是单链重组工程。它通过在Red/ET重组系统中诱导RedB或RecT重组酶的表达将单链核苷酸整合到细菌染色体中Error:Referencesourcenotfound。