第二章细胞生物学实验技术VIP免费

第1页共18页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第1页共18页第二章细胞生物学研究方法第一节显微技术显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。—、光学显微镜（一）、普通光学显微镜普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便（图2-1）。图2-1尼康E-600显微镜显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关，分第2页共18页第1页共18页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第2页共18页辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为：R=0.61λ/N．A．N．A．＝ｎsinα/2式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numericaperture）。镜口角总是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。表2-1及中介质的折射率介质空气水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.66制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。（二）、荧光显微镜第3页共18页第2页共18页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第3页共18页图2-2尼康E800荧光DIC显微镜细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜（图2-2，3，4）就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。第4页共18页第3页共18页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第4页共18页图2-3落射式照明原理荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（图2-3）；2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。图2-4荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色），图片来自http://www.itg.uiuc.edu（三）、激光共聚焦扫描显微境第5页共18页第4页共18页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第5页共18页图2-5激光共聚焦扫描显微镜图2-6LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管，图片来自http://www.itg.uiuc.edu激光共聚焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmicroscope，图2-5、6）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都第6页共18页第5页共18页编号：时间：2021年x月x日书山有路勤为径，学海无涯苦作舟页码：第6页共18页储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。（四）、暗视野显微镜暗视野显微镜（darkfieldmicroscope，图2-7）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。图2-7暗视野照明方式（五）、相差显微镜相差显微...