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蛋白质与脂肪酸间结合检测方法及研究进展食品学院B09107258刘贺摘要：蛋白质与脂肪酸间作用方式已用多种方法进行过实验。除传统方法外，近年来在油脂界应用较多的结构X-衍射和NMR方法也为这个领域带来了巨大变化。本文综述了迄今为止常用的研究脂肪酸与蛋白质结合的方法并对一些最新进展进行了分析。关键词：脂肪酸蛋白质FABPsAbstract:Theinteractionsoffattyacidswithproteinshavebeenstudiedbyavarietyofconventionalapproachesfordecades.Inadditiontotraditionalmethods,theapplicationoftechniquesofstructuralbiologysuchasX-raycrystalandNMRhasbroughtaboutdramaticadvancesinthisimportantareaoflipidresearch.Keywords:fattyacid;protein;fattyacid-bindingproteins数十年以来脂肪酸与蛋白质间作用力均用各种传统方法进行研究，且所得到的有效信息较少。近些年来，结构生物学方法如X-衍射和NMR法的应用对这一领域的油脂研究带来了巨大变化。几种蛋白质的高分辨率的X-衍射和NMR图谱揭示了蛋白质的完整三级结构以及其与脂肪酸的相互作用方式。本文对目前常用的FABP检测方法如免疫检测法、X-衍射法、核磁共振(NMR)法及传统分析方法等及其研究进展进行了综述。文中所总结的结合脂肪酸的蛋白质有常见的人血清白蛋白和脂肪酸结合蛋白。迄今为止已有至少17种脂肪结合蛋白被明确鉴定[1]，而其中至少10种都属于脂肪酸结合蛋白(FABP)[2]。FABP是一族分子量为14~16kD的蛋白质，至少有9种类型：肝、小肠、心、脑、肾、骨骼肌、脂肪组织、回肠、表皮等，通过亲和层析的方法可以从以上不同组织细胞获得相应的纯品。这一族蛋白还包括细胞视黄醇结合蛋白Ⅰ和Ⅱ。FABP在体内的含量丰富，占细胞内可溶性蛋白总量的3~8%。所有FABP的氨基酸系列有38~70%的等同性[3]。组织损伤后，细胞蛋白质会从血浆中释放出来，对于局部缺血、再灌注、神经紊乱、癌症或器官排异等引起的组织损伤，FABP可作为一种可靠的生物标志蛋白。不同亚型的FABP在评价脑损伤、骨骼肌损伤、肾脏损伤、肝脏损伤等的应用是最近研究的热点，因此检测FABP，并了解脂肪酸与FABP间作用方式及作用特点具有重要的价值[4]。1免疫检测法有关FABP定量检测的最早报道是Ockner等1974年在研究I-FABP时采用的放射免疫法[5]。在此测定方法中，Ockner等首先通过凝胶过滤柱层析及等电聚焦电泳获得纯化的I-FABP，然后用纯化I-FABP免疫家兔以获得I-FABP抗血清并用14C进行放射性标记。14C标记抗血清与特测标本反应后，通过测定免疫沉淀中放射性比活度来植测相应I-FABP的浓度。Ockner等报道的方法准备过程及测定过程都较为繁琐，价格昂贵且存在放射性污染，但为FABP测定方法的改进奠定了基础。1997年，Wodzig等[6]成功地开发了检测H-FABP的一步夹心ELISA法，与两步ELISA法的灵敏性和特异性基本相同。2004年，Pelsers等人[7]利用亲和纯化重组人源化的抗B-HABP多克隆抗体开发了B-FABP检测的夹心ELISA法。ELISA法是FABP定量测定的一个标准的方法。2X-衍射法许多研究者用不同方式来研究脂肪酸与白蛋白间作用方式[8]。1980年，Brown根据氨基酸序列以及二硫键位置，并且考虑了当时的生物物理及生物化学研究，从而提出了白蛋白的具体三级结构[9]。这个模型虽然较为美观但是推测性太大，在以X-衍射研究脂肪酸与白蛋白间作用出现以前，大量的研究结果只得到一张关于白蛋白与脂肪酸作用的低分辨率的图片。蛋白化学家与油脂学家都急切想了解白蛋白的具体三级结构。为达到此目标，实验中遇到了许多阻碍，其中包括膜衍生白蛋白，即异源纯化及结晶均难度较大。1994年，X-衍射用于研究从人体血清纯化出的白蛋白结晶[10]，后来又将其应用于重组体蛋白质，从而第一次提供了这种重要蛋白质的精确图片。这张高分辨率的结构展示出这种蛋白质总体呈心形而不是这位作者之前所说的“圆柱形”[11]。其他研究者也随后以X-衍射研究了心形的脱脂蛋白质和与脂肪酸结合后的蛋白质(图1A)。脱脂蛋白质有一个复杂的结晶结构；它没有Brown所说的较简单且有三个圆柱的对称结构，脂肪酸如何结合进这种结构也没有任何证据。目前最完整且分辨率较高的脂肪酸-白蛋白结合图是用X-衍射法...