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生物技术132孟庆猛1309011066合成生物学中那些不得不说的技术20世纪的生物学研究一直着眼于对生物系统的不断分解,解剖至细胞中单个蛋白或基因,研究其结构和功能来解释生命现象。但随着当代分子生物学技术的迅猛发展,以系统化设计和工程化构建为理念的合成生物学成为新一代生物学的发展方向。合成生物学旨在对多种天然的或人工设计的生物学元件进行合理而系统的组合以获得重构的或非天然的“生物系统”,其涵盖的研究内容可以大体分为3个层次:一是利用已知功能的天然生物模体(motif)或模块(module)构建成新型调控网络并表现出新功能;二是采用从头合成(denovosynthesis)的方法,人工合成基因组DNA并重构生命体;第三个层次则是在前两个研究领域得到充分发展之后,创建完整的全新生物系统乃至人工生命体(artificiallife)。合成生物学强调利用工程化的设计理念,实现从元件到模块再到系统的“自下而上”设计。利用生物系统最底层的DNA、RNA、蛋白质等作为设计的元件,利用转录调控、代谢调控等生物功能将这些底层元件关联起来形成生物模块,再将这些模块连接成系统,实现所需的功能。这是一门涉及微生物学、分子生物学、系统生物学、遗传工程、材料科学以及计算科学等多个领域的综合性交叉学科。它有别于传统的基因工程,其目的在于组装各种生命元件来建立人工生物体系,让它们能像电路一样在生物体内运行,使生物体能按预想的方式完成各种生物学功能。合成生物学的最高境界是灵活设计和改造生命,重塑生命体。本文就目前合成生物学采用的关键技术和研究应用进展两方面进行综述。基因组的人工合成技术2010年5月20日,Science报道了Venter研究组采用化学方法合成了一个1.08Mb的蕈状支原体基因组,并将其移植入一个山羊支原体受体细胞,从而创造了一个仅由合成基因组控制的新的蕈状支原体细胞。这项成果在合成生物学的发展史中具有里程碑的意义。在此之前,也有许多基因组合成的成功报道。2002年,纽约州立大学Wimmer实验室合成了脊髓灰质炎病毒,这是人类历史上第一个人工合成的病毒。多年来,Venter等一直致力于合成基因组的研究。2003年,合成了长达5386bp的ΦX174噬菌体基因组,实现了用寡核苷酸合成的方法精确合成了5~6kb的DNA序列;2008年,Venter实验室又合成了生殖支原体基因组,该基因组全长582970bp,是已知的生物体中独立生存的最小基因组;2010年10月他们又发明了迄今最简单有效的基因合成技术,并以此合成了实验小鼠的线粒体基因组。Dymond等的研究更进了一步,他们于2011年报道成功设计合成了酿酒酵母的部分染色体,这是酿酒酵母基因组人工合成计划(SC2.0Project)取得的第一个成果,该项目的最终目标是人工合成构建酿酒酵母基因组。酵母基因组人工合成将是合成生物学发展史上又一重要的里程碑。DNA合成是支撑合成生物学发展的核心技术,它不依赖于DNA模板,可根据已知的DNA序列直接合成,在基因及生物元件的合成、基因回路和生物合成途径的重新设计组装,以及全基因组的人工合成中发挥重大作用。由于化学合成的DNA片段长度有限,要合成长的DNA片段需要先合成短的寡核苷酸,然后再将寡核苷酸进行拼接。因此,基因组合成的基本思路为:①按照原始基因组序列设计合成寡核苷酸;②利用各种方法将寡核苷酸拼接成较长的DNA序列;③以较长的序列为基础,进一步拼接得到更长的DNA序列,拼接成完整的基因组;④将合成的基因组移植到细胞中,并验证其功能。一、寡核苷酸的合成目前寡核苷酸一般采用固相亚磷酰胺三酯法合成。寡核苷酸的长度是一个重要的参数,随着长度的延长,产率下降,纯度也降低,积累的合成错误大大增加。较短的寡核苷酸会有较少的错误,但是需要增加组装所需的重叠序列,使合成成本增加。使用60-mer的寡核苷酸,可以最大程度地降低错配率和生产成本。二、由寡核苷酸拼接成较长的DNA片段寡核苷酸可以通过各种方法拼接成几百bp到几千bp的DNA片段。常用的体外拼接方法有以下两种:连接酶链式反应(ligasechainreaction,LCR)和快速聚合酶链式组装法(polymerasechainassembly,PCA)。LCR法利用Taq连接酶将首尾相连、重叠杂交的寡核苷酸片段连接起来...

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