GB4789.7-2013副溶血性弧菌检验•一、概述•二、生物学特性•三、检测方法•副溶血性弧菌Vibrioparahaemolyticus于1950年从日本一次暴发性食物中毒中发现。•该菌存在于近海海水、海底沉积物和鱼类、贝壳等海产品中。在37℃、pH7.7、3～4%NaCl环境中生长最好。一、概述概述•本菌嗜盐畏酸怕冷，在无盐环境不能生长，3%～6%盐水繁殖迅速，低于0.5%或高于10%盐水中停止生长。对酸敏感，在2%醋酸或50%食醋中1min即死亡。不耐热，56℃5min可杀死，90℃1min灭活。对高盐浓度抵抗力甚强。5℃以下容易死亡。•分类：属弧菌科(Vibrio)，弧菌属。•分布：主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海产品中。人多因食用被本菌污染而又未煮熟的海产品和其他食品而引起中毒。流行病学•季节分布：8-9月为高峰期•中毒食品：主要为海产品、其次为水产制品、淹制品、咸菜及污染食品•地区分布：沿海地区居多•临床症状：主要有腹痛、腹泻、恶心、呕吐、发热•潜伏期：10小时左右致病作用•主要引起胃肠炎，最常见的是食物中毒和感染性腹泻。由于病菌在食品中大量繁殖，侵入肠道后继续繁殖并释放出大量肠毒素，引起剧烈的胃肠炎。二、生物学特性---菌体形态及染色特征•革兰氏阴性杆菌，无芽孢•0.3~0.7×2~6µm两端浓染呈多形态（棒状、弧状、球状、卵圆形等）排列不规则•液体培养基生长单鞭毛，固体培养基常有周生鞭毛（侧毛）二、生物学特性---培养特性•需氧兼性厌氧•在含NaCl3-4%的培养基中生长良好•无盐和NaCl10%的培养基中均不生长•最适培养温度为：30--37℃•最适pH范围：pH7.4-pH8.2•在固体培养基上，菌落通常隆起，圆形半透明，表面光滑、湿润、一般不产生色素。•在血平板和嗜盐性平板上，菌落生长良好。•肉汤、琼脂、生化管都应含有3-4%的NaCl含量。•神奈川现象(Kanagawaphenomenon，KP)--在特定条件下，某些菌株在含高盐(7％)的人O型血球或兔血球及以D甘露醇作为碳源的我妻琼脂平板上产生β溶血的现象•神奈川现象与本菌的致病性密切相关血清分型•O抗原（耐热的菌体抗原）O1-O13共13种•K抗原型（荚膜抗原）K1-K71共65种•H抗原（鞭毛抗原），无特异性三、检测程序食品安全国家标准副溶血性弧菌检验GB4789.7-2013GB4789.7-20131、样品制备•食品样品鱼类：表面组织、肠、鳃贝类：全部内容物（贝肉和体液）甲壳类：动物的中心部分，包括肠、鳃水产制品•如为带壳贝类或甲壳类，应先在自来水中洗刷外壳并甩干表面水分，然后以无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分。2、增菌--3%氯化钠碱性蛋白胨水定性--取样品25g（mL），加入3%氯化钠碱性蛋白胨水225mL。定量--选择3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种3支含有9mL3％氯化钠碱性蛋白胨水的试管，每管接种1mL。置36±℃1℃恒温箱内，培养8h～18h。3、分离—TCBS平板、弧菌显色平板•对所有显示生长的增菌液，用接种环在距离液面以下1cm内沾取一环增菌液，于TCBS平板或弧菌显色培养基平板上划线分离。一支试管划线一块平板。于36±1℃℃培养18h～24h。TCBS平板上典型特征•典型的副溶血性弧菌在TCBS上，呈圆形、半透明、表面光滑的绿色菌落。TCBS平板上典型特征科玛嘉弧菌显色平板--紫色菌落4、纯培养•挑取3个或以上的可疑菌落，划线3％氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36±1℃℃培养18h～24h。5、初步鉴定•氧化酶试验•涂片镜检•3%氯化钠三糖铁•嗜盐性试验•底层变黄不变黑，无气泡，斜面颜色不变，有动力6、确定鉴定•甘露醇发酵试验--含3%氯化钠的培养基•赖氨酸脱羧酶试验•V-P试验•ONPG试验—采用3%氯化钠三糖铁琼脂隔夜培养物进行•副溶血性弧菌：甘露醇+赖氨酸脱羧酶+V-P-ONPG-ONPG试验•挑取1满环新鲜培养物接种于0.25mL3%氯化钠溶液，在通风橱中，滴加1滴甲苯，摇匀后置37℃水浴5min。加0.25mLONPG溶液，36℃培养观察24h。•阳性结果呈黄色。阴性结果则24h不变色。ONPG--邻硝基酚-β-D-半乳糖苷可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。•API20E7、选做试验•血清学分型--11种O抗原血清•神奈川试验--我妻氏血琼脂平板8、结果与报告•根据检出的可疑菌落生化性状，报告25g（mL）样品中检出副溶血性弧菌。•如果进行定量检测，根据证实为副溶血性弧菌阳性的试管管数，查最可能数（MPN）检索表，报告每g（mL）副溶血性弧菌的MPN值。
