卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法VIP免费

卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法用途：本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。安全解冻配套：1.1瓶4ml解冻液（TS）2.1瓶1.5ml稀释液(DS)3.1瓶1.5ml冲洗液(WS)4.1个25mm的培养皿(用于解冻液)5.1个6孔生殖板使用说明准备：*用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。*用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um)解冻：1.迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。（图一）2.用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。（图二）3.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1底部，浸泡5分钟。（图三）4.用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。（图四）5.将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。放进37℃的培养箱中完成恢复。注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。质量控制测试：每一批安全解冻配套都得到以下测试：*溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL10-3）LAL拉尔内毒素测试小老鼠胚胎试验（一个细胞）保存方法：*保存于4-8℃*在标签所示有效日期前，本品性质稳定。成分：*血清替代补充*基本培养基M-199内含的HEPES*蔗糖参考文件（此部分请看原件）.玻璃化第一部分：所需材料*玻璃化配套No.0基础液（BS）：1.5mlx1(只用于卵母细胞玻璃化冷冻)No.1稀释液（ES）:1.5mlx1No.2玻璃化溶液（VS）:1.5mlx2*冷冻管x4,建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎*复制板x2:6孔*冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB)*巴斯德管（型号：MT-150）*显微镜（关掉加热板）*秒表或计算器（带计算功能）*液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤）*镊子*显微针x2:2-20ul,100-1000ul*罐子*储存罐注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。（卵母细胞内直径：140um，胚胎内直径：140-200um），尽量减少与玻璃解冻液的接触以提高解冻后的成活率。平衡这个步骤，卵母细胞与胚胎步骤不一样。第二部分玻璃化准备1.将BS、ES和VS放到室温25℃--27℃。2.在管上写上客户信息3.冷却架要添加液氮至90%4.将装有卵母细胞或者胚胎的培养皿从培养箱中取出，用巴斯德管取出卵母细胞或者胚胎在显微镜下观察卵母细胞或胚胎的质量状况。注意：如果用的是卵母细胞则要将积云细胞出去。第三部分平衡卵黄周隙透明带比较卵黄周隙与透明带的宽度，并做记录,这样更容易知道在ES浸泡后完成平衡液步骤。卵母细胞—平衡1在复制板边上分别写上BS,VS1和VS2.用巴斯德管取出20ul的BS，300ulVS1和300ulVS2,放进复制板里（看下图）。卵母细胞—平衡2用巴斯德管取出卵母细胞，将其转移到BS（20ul）溶液底部。卵母细胞—平衡3(3分钟)调整秒表（有计算功能），为以下步骤检查并设定好秒表。沿着复制板孔的边缘移动巴斯德管，轻轻地将20ulES增加到有卵母细胞BS溶液的顶部，放置3分钟。卵母细胞—平衡4(3分钟)仿照上个步骤再增加20ulES溶液到顶部，放置3分钟。卵母细胞—平衡5(9分钟)仿照上个步骤再增加240ulES溶液到顶部，放置9分钟。在平衡液这个部分，卵母细胞大小要完全恢复，在卵母细胞在ES浸泡前，卵黄周隙宽度平均的时候，这个部分就完成了。玻璃化配套胚胎平衡胚胎--平衡1在复制板边上分别写上ES,VS1和VS2.将将ES和两瓶VS充分混合。用巴斯德管分别取出300ul溶液，立刻放进复制板里（看右图）。胚胎--平衡2用巴斯德管吸取胚胎于巴斯德管顶部，看右图。然后将胚胎放到ES中顶部。胚胎--平衡3（12到15分钟）调整秒表（有计算功能），为以下步骤检查并设定好秒表。胚胎于30秒内自由脱落，它会自发地开始收缩，在ES渗透后，胚胎就会逐渐恢复到原来的大小，此时平衡步骤就完成了。注意：胚泡平衡要等待卵黄周隙消失。胚泡玻璃化解冻最好的时候是胚胎直径达到140-180ul的时候。胚胎平衡的时间取决于胚胎的大小和质量，好的胚胎和小的胚胎所需时间就比较少。举例来说，一个好的胚胎8分钟完全恢复，平衡步骤已经完成。如果不能确定胚胎是否完全恢复，则停止平衡，12分钟进行原核...