细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体CellFusionandCellFusionandMonoclonalAntibodiesMonoclonalAntibodies4.1细胞融合4.2杂种细胞的遗传特性和应用4.3淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体技术4.1细胞融合4.2杂种细胞的遗传特性和应用4.3淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体技术4.1细胞融合4.11聚乙二醇介导的细胞融合4.12细胞电融合4.13杂种细胞的筛选4.14.1细胞融合细胞融合定义定义：指用自然：指用自然或人工方法、使或人工方法、使两个或更多个不两个或更多个不同的细胞融合成同的细胞融合成一个细胞的过程，一个细胞的过程，又称为体细胞杂又称为体细胞杂交交4.114.11聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）介导的细胞融）介导的细胞融合合原理：PEG带有大量的负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH,高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。影响因素：影响因素：分子量：400—6000（通常：1000—4000）浓度：20—60%（通常：30—50%）时间：悬浮法1—2min离心法5—8minpH：偏碱为宜（pH7.4—8.0）其他：二甲亚砜、植物血凝素4.124.12细胞电融合细胞电融合原理：悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在1—100MHz和100—1000V/cm的交流电场中，会向小电极移动，并极化成偶极子，而沿电场方向发生双向电泳，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电降解，从而触发细胞融合。双向电泳：在交流电场的作用下（1MHz，150V/cm）细胞膜上正负电荷分离，产生偶极，两个极化的细胞会发生相互的紧密接触。•可逆电降解：在高频电场的脉冲作用下（50ms，电场强度1.2－2kV/cm），细胞膜上的离子发生位移，而使电荷分开，细胞质膜产生电势，正、负电荷相互吸引，细胞膜变薄，随细胞势的增加，膜降解穿孔，形成微孔。•电场诱发的微孔面积和数目与细胞膜总表面积相对不大时，微孔可以重新封闭。电场示意图甜菜原生质体电融合过程1）在高频电流电场下的相互接触。2）脉冲刺激后30s3)50秒后4）1.5分钟后5）6分钟后6）15分钟后，原生质体融合完成。注意事项注意事项1）对介质要求高，一般用高纯度的蒸馏水并选用适当的非电介质溶液，如甘露醇等配制等渗性介质。2）注意控制高频交流电压和直流脉冲电压的强度和时间，以防止细胞连接成串或发生可逆性降解。优点：优点：融合率高，达70％－80％，甚至100％融合率＝（融合组多核细胞的核数－对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞4.134.13杂种细胞的筛选杂种细胞的筛选原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。1）亲本2）同核体：同源原生质体的融合体3）异核体：非同源的原生质体的融合体4）多核体：含有双亲不同比例核物质的融合体5）异胞质体：具有不同胞质来源的杂合细胞。6）核质体：有细胞核而带有少量细胞质的亚原生质体植物细胞筛选方式植物细胞筛选方式1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。如亲本1：叶绿体缺陷型亲本2：光致死型两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。如：亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体亲本2：叶肉细胞原生质体在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分4）利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应...
