新生大鼠海马脑片培养方法王勇２，朱小南１，陈汝筑１，何进１，余剑平１，汪雪兰１（１．中山大学中山医学院药理学教研室，广东广州５１００８９；２．南方医科大学珠江医院临床药理基地，广东广州５１０２８２）摘要：目的建立新生大鼠海马脑片体外长期培养方法。方法取出生后１０ｄ的新生大鼠海马，切成３００μｍ厚的脑片，转至带有微孔膜插件的培养皿中进行培养。培养期间进行形态学观察，并通过ＭＴＴ法鉴定组织活力，免疫组化法观察胶质细胞对损伤的反应，电生理反应以检测神经细胞功能。结果培养海马脑片逐渐变薄，５ｄ后结构清晰，细胞形态完整；ＭＴＴ法显示培养４０ｄ内的海马组织均能保持高摄入ＭＴＴ能力；在Ｓｃｈａｆｆｅｒ侧枝给予单脉冲刺激，于ＣＡ１区能接收到完整的群峰电位；谷氨酸导致胶质细胞抗胶质纤维酸性蛋白高表达。结论本方法培养４０ｄ的海马脑片具有正常的活力和功能。关键词：海马；海马脑片，培养的；模型，动物中图分类号：Ｒ９６５．２文献标识码：Ａ文章编号：１０００３００２（２００５）０１００７００５对神经系统许多功能的研究，最理想的条件是保持在体固有的、立体的神经细胞之间及神经细胞与非神经细胞之间动态联系的基础上进行，这种在体细胞间固有的完整联系通过神经细胞培养是不能实现的。但是，在体研究最大的困难在于实验受制约因素太多，不便控制实验条件和观察实验结果。体外培养的脑片包含了与在体脑组织相同的细胞种类及细胞的三维空间结构，保存了正常完整的突触回路、受体分布、递质传递和其他生理功能［１］。脑片的体外长期培养为研究药物和毒物对中枢神经的慢性作用［２，３］、神经损伤与修复［４］、神经发育［５］等提供收稿日期：２００４０５１７接受日期：２００４１０２２基金项目：广东省自然科学基金（０４０２０４３０）作者简介：王勇（１９６６－），男，重庆市人，医学博士，副教授，主要从事药理与毒理学、分子生物学研究。联系作者Ｅｍａｉｌ：１９６６７３＠１６３．ｃｏｍＴｅｌ：（０２０）６１６４３５５５Ｆａｘ：（０２０）６１６４２９８３了理想的条件。由于体外培养脑片突出的优越性，因此脑片培养技术十分重要。随着脑片培养技术的不断改进，目前国外不仅建立了新生鼠海马脑片培养技术，而且还探讨了成年鼠海马脑片的培养技术［６］。但在培养海马脑片长期成活的基础上，系统地观察培养海马脑片的生理功能尤其是神经冲动传输的研究报道目前还不多。本研究采用微孔膜插件培养海马脑片，并通过多种方法鉴定培养海马脑片的存活和功能。１材料与方法１．１动物、试剂与仪器新生１０ｄ的Ｗｉｓｔａｒ乳大鼠由中山大学实验动物中心提供，ＭＥＭ培养基、马血清购于ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司，膜插件（ｍｅｍｂｒａｎｅｉｎｓｅｒｔ）为Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司产品；噻唑蓝（ＭＴＴ）、抗胶质纤维酸性蛋白（ｇｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｒｙａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＦＡＰ）抗体、焦油紫均购于Ｓｉｇｍａ公司。体视显微镜（ＯｌｙｍｐｕｓＳＺＸＩＬＬＢ２００）、振动切片机（ＭＡ７５２ｍｏｔｏｒｉｓｅｄａｄｖａｎｃｅｖｉｂｒｏｓｌｉｃｅ）、电位记录系统（ＮｉｈｏｎＫｏｈｄｅｎ）、显微镜（ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ４０ＰＤＨＪ１１）和细胞培养箱（ＦｏｒｍａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ３１１１）。１．２脑片培养脑片制备参照Ａｄａｍｃｈｉｋ等［７］方法。将出生后１０ｄ的乳鼠用７５％乙醇浸泡消毒后，断头取脑，迅速置于预冷的解剖缓冲液中，分离出完整的海马。将海马放置于振动切片机的载物平台上，在解剖缓冲液中以３００μｍ厚度进行切片。膜插件处理：在每一培养皿中放置一个膜孔为０．２２μｍ的膜插件，加入１ｍＬ含２５％马血清的ＭＥＭ培养液使培养插件膜润湿至半透明，并于培养脑片前１ｈ放入３７℃细胞培养箱中以调节培养基的酸碱度。脑片孵育：经过漂洗的每３～４块海马脑片被置于同一膜插件上，在解剖镜下使其分布均匀。脑片·０７·中国药理学与毒理学杂志ＣｈｉｎＪＰｈａｒｍａｃｏｌＴｏｘｉｃｏｌ２００５年２月；２００５Ｆｅｂ；１９（１）：７...
