BNPAGE在分析蛋白质中的应用VIP免费

畜牧与饲料科学AnimalHusbandryandFeedScience2009，30(3)：28—30BN—PAGE在分析蛋白质中的应用蔡家海，刘春林(湖南农业大学农学院，植物资源与利用国家重点培养实验室，湖南长沙410128)摘要：采用温和凝胶电泳系统可以有效地分离蛋白质复合物，结合SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳系统可以将多亚基蛋白质分离。利用免疫印记对蛋白质复合物进行初步鉴定。同时还可以利用蓝绿温和凝胶电泳系统分析复合物的组成。关键词：蓝绿温和凝胶电泳；蛋白质复合物；聚丙烯酰胺凝胶；免疫印记中图分类号：Q503文献标识码：A文章顺序编号：1672—5190(2009)03-0028-03以等电聚焦(isoeleetriefocusing，IEF)为第一向的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D—PAGE)是目前分离蛋向质最常用的技术⋯。但是～些分子质量较大的蛋白质(200ku)，偏酸偏碱的蛋白质以及疏水性较强‘的膜蛋白质的分离．采用2D—PAGE往往不能得到理想的结果。1991年，Schagger等为了研究哺乳动物和真菌线粒体中的多亚基蛋白质复合物．建立了一种蓝绿温和凝胶电泳系统(blue-nativepolyacrylamidegeleleetrophoresis，BN-PAGE)。BN—PAGE称之为蓝绿温和凝胶电泳C2：。是以考马斯亮蓝G一250D代替SDS使蛋白质复合物带负电荷，用温和的去污剂，如dodecylmaltoside(DM)、TritonX一100和毛地黄皂苷(digitonin)等增溶膜蛋白复合物，从而使复合物以近似天然的形态分离。这种方法随后被用于各种生物膜。包括质膜、类囊体膜、叶绿体外膜等系统的研究[2-3]。在蛋白复合体得到分离后．将第一向的泳道切下进行第二向的SDS—PAGE，各个复合物的亚基就能得到分离C4]。目前结合更加精益求精的增溶方法，BN—PAGE已经被用来检测较大蛋白质复合体的相互作用，导致了超级复合体的出现⋯31，按该观点可以用BN—PAGE调查研究植物蛋白质复合体的结构以及各个亚基之间的相互作用。1BN胶1．1BN—PAGE电泳分离的原理传统的变性SDS—PAGE技术中，离子型变性剂SDS的功能包括增溶和使蛋白质变性．同时提供负电荷，因此蛋白质的流动是单向的。在BN—PAGE中这种多重的功能可以通过不同的去污剂来实现15-6]。有时候变性不是我们所希望的，但是对于膜蛋白复合物的增溶是必需的．这可以通过温和的非离子型变性剂：dodecylmaltoside(DM)、TritonX一100和digitonin来加以控制。在此负电荷附加到溶解的蛋白质复合体上不是通过变性。而是依靠附加和绑定了带负电荷的考马斯亮蓝G250。1．2样品的制备一直以来BN—PAGE分析的是细胞器中与呼吸链有关的蛋白复合体，而其可能是高丰度的，低丰度的蛋白复合物也可能存在在这些细胞器中．对于较少的样品原料，我们也需要对复合物有一个很好的观察。但是这些复合物可能在BN—PAGE中留在底部或者被高丰度的复合收稿日期：2009一03—09基金项目：国家963计剐。作者简介：蔡家海(198卜)，男，项士．主要研究方向为分子生物学与基因工程。物遮蔽．这就要求人们在BN—PAGE技术中应对感兴趣的复合物进行预处理。例如：透析、超滤：去除高丰度的蛋白复合物可以用亲和层析和分馏：分段分离除利用复合物的大小外还可以利用它的特性，如亚细胞器分离、离子交换层析(7-S】。1．2．1膜样品的增溶：与IEF相比。BN—PAGE所测试的去污剂相对来说仍很少．在研究膜蛋白复合物中。寻找合适的去污剂对于增溶不同的蛋白复合物是个关键。在BN—PAGE中适合增溶蛋白复合物的去污剂必须满足几个必要条件。它必须足够温和，但是能够破脂质一脂质之间的相互作用。不干扰复合体中蛋白质的组成。破裂一个复合体的时候，去污剂也不应该干扰电泳。破裂某一个类脂一蛋白质联合通常不是我们希望的，因为这有可能导致弱化或者分解蛋白复合体【9l。常用的去污剂有n—Dodecylmaltoside(DM)和TritonX一100，另外Octylgucoside，Brij96和Saponin。其他非离子型去污剂包括大分子量的CHAPS、C12E518，NP---49可能也适合增溶膜蛋白复合体。通过不同的去污剂与不同盐类中蛋白质比率的测试．来确定最佳的去污剂和正确的增溶条件mj。1．2．2制备可溶性复合物：关于用BN—PAGE技术分析可溶性蛋白复合物的报道到目前为止还比较少。直接利用可溶性植物细胞的提取物进行BN—PAGE可能导致图形模糊...