www.vazyme.com使用说明书Vazymebiotechco.,ltd.www.vazyme.com销售/sales:sales@vazyme.com技术支持/technicalsupport:support@vazyme.comVazymeBiotechCo.,LtdApoptosisDetectionKitAnnexinV-FITC产品概要产品组成贮藏与保质期实验方案样品染色样品分析参考实例：流式细胞仪检测TRAIL诱导的Jurkat细胞凋亡操作注意事项常见问题与解决方案01/02在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的细胞膜结合。因此AnnexinV被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinV进行绿色荧光（FITC或EGFP）标记，以标记了的AnnexinV作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（AnnexinV-/PI-）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（AnnexinV+/PI-）；右上象限是凋亡晚期细胞和坏死细胞，为（AnnexinV+/PI+）。本试剂盒所有组分均在4-8°C保存，长期不用可将AnnexinV-FITC放-20°C保存。1/产品概要3/贮藏与保质期2/产品组成组分A211-01(50rxn)A211-02(100rxn)AnnexinV-FITCPIStainingSolution1×BindingBuffer250µl250µl25ml250µl×2250µl×225ml×2Catalog目录www.vazyme.com03/044/实验方案5/参考实例：流式细胞仪检测TRAIL诱导的Jurkat细胞凋亡4.1样品染色www.vazyme.com4.2样品分析A.流式细胞仪分析：激发波长为488nm；FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测，建议使用FL3。用CellQuest等软件进行分析：绘制双色散点图(two-colordotplot)，FL1为横坐标，FL3为纵坐标。每个样采集10,000events。典型的实验中细胞可以分成三个亚群：活细胞仅有很低强度的背景荧光；早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光；晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。1.悬浮细胞：300g,4°C离心5min收集细胞。贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g,4°C离心5min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。2.用预冷的PBS洗涤细胞两次，每次均在300g,4°C离心5min。收集1~5×105细胞。3.加入100μl1×BindingBuffer重悬细胞。4.加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPIStainingSolution,轻轻混匀。5.避光、室温反应10min。6.加入400μl1×BindingBuffer,混匀，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。注意：为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。用凋亡诱导剂TNF-relatedapoptosis-inducingligand(TRAIL)诱导JurkatT淋巴瘤细胞凋亡，诱导剂的浓度为0、0.5、1.5、4.5、13.5ng/ml，分别诱导3h后，参照第4节操作方法，用流式细胞仪检测结果见下图。(A)0ng/ml.(B)0.5ng/ml.(C)1.5ng/ml.(D)4.5ng/ml.(E)13.5ng/mlTRAIL.(F)竞争封闭实验，采用13.5ng/mlTRAIL诱导Jurkat细胞凋亡3小时后，加入10μg未标记的AnnexinV封闭10分钟，再用AnnexinV-FITC/PI染色。未标记的AnnexinV可以竞争AnnexinV-FITC，证明了染色的特异性。6/操作注意事项1.由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。2.对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色；处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞，胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与AnnexinV-FITC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可...
