蛋白纯化层析柱--GE 详细介绍VIP免费

蛋白纯化层析柱2011-06-1515:19:14易生物仪器浏览次数：1164网友评论0条从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是...关键词：蛋白离子交换分离分子物质树脂从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gelfiltration，GF），离子交换层析技术（ionexchange，IEX），羟基磷灰石层析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用层析（hydrophobicinteraction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performanceliquidchromatography，HPLC）。对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GEHealthcare（原AmershamBiosciences）的技术顾问AndrewMitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步：捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白；区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白；修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flowrate）的填料。bead大小比较大，范围比较宽（比较于bead大小平均值）的“fastflow”填料比较理想，这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead比较合适。吸附性的技术，比如离子交换IEX和疏水作用HI通常被用在纯化的这前两个步骤，而凝胶过滤则会留到了最后的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。选择柱料的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，IEX和HI层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用，而GF的选择性依赖于填料的分馏范围（fractionationrange）。柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，Mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。bead越大，洗脱峰就越不集中，柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)凝胶过滤法（gelfiltration）也称为排阻层析（exclusionchromatography）、凝胶层析（gelchromatography）或分子筛层析（molecularsievechromatofraphy），它是在1960年后发展出来的技术。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。目前常用的凝胶包括3个主要类型：1.PolydextranPolydextran的商品名称是Sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型号，如G-25、G-75、G-100或是G-200，G后面的数字为凝胶吸水量再乘以10，以G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5ml。GE的Sephad...