浙江农业学报!"#$!%&’"()#(&$*+,*-’$.%*./’/!"（#）：!!$%!!&，#’’(分子生物技术检测桑花叶型萎缩病原费建明!，白锡川#，于峰)，赵航*，王文兵)，蒯元璋*，!（!湖州市农业科学研究院，浙江湖州)!)’’’；#湖州市农林推广服务中心蚕桑技术指导站，浙江湖州)!)’’’；)江苏大学生命科学研究院，江苏镇江#!#’!)；*中国农业科学院蚕业研究所，江苏镇江#!#’!&）摘要：根据多年对桑花叶型萎缩病的追踪研究，分离获得了病桑组织类似类病毒的小分子+,-，对其部分序列进行解析，并以之作为病原物的分子标志物，用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、点杂交和,./012/3456.0等分子生物技术方法检测症状明显的病株，取得了比较理想的结果。关键词：桑花叶型萎缩病；类病毒；检测；分子生物学中图分类号：7&&&8(!文献标识码：-文章编号：!’’*9!$#*（#’’(）’#9’!!$9’*!"#"$#%&’&()*#+&,"’&(-./0"112-&3*%$45*1(4%3"*3"02-&/"$./*10%&/&,2#"$+6’%7."3:;<=>?4@>3A!，B-4D1E?3A#，FG:23A)，HI-JI?3A*，K-,LK2345>3A)，MG-*&&5#*",.’"$)%(’3$."*，0(1,2(898:::，;,’.$；)?./#’#(#*26@’6*7"’*."*，A’$.%/(B.’C*&/’#5，+,*.-’$.%D9D:98，;,’.$；*7*&’"()#(&$)E*/*$&",?./#’#(#*，;,’.*/*!"$3*4526!%&’"()#(&$)7"’*."*/，+,*.-’$.%D9D:9F，;,’.$）803#1*$#：<3!""!，?6?O@.62DE6?/O2>A10+,-P>@>6?/0.Q>/.>RO?PS.E3R>3012R>P2?P2R@E652//T./A?3>N?0>.38-DD./R>3A0.012?DDE@E6?0>.32Q>R23D2P.S@?3TT2?/P，012Q>/.>R46>U2+,-O?PR202D02R>3012@.P0>3S2D02R@E652//T8<0PV?/0>?6P24WE23D2O?PR202/@>32R8X126?O@.62DE6?/+,-?P?@?/U2/O?PEP2R0.R202D0@E652//TR>P2?P25T012+20E/3Y-L;，Z.056.0，?3R,./012/356.08X12>R2?6/2PE60PO2/2.50?>32R>301>PP0ERT?3R012@201.RPD.E6R52EP2SE6S./D.30/.6.S012R>P42?P289"25&143：@E652//T@.P?>DRO?/SR>P2?P2；Q>/.>R；R202D0>.3；@.62DE6?/5>.6.AT桑花叶型萎缩病又称“癃桑”。早在!)!)年古农书中就有记载。现在江、浙蚕农所谓的“癃桑”，实际上具有多种症状。其中，叶部呈现黄绿相间的花叶症病害定名为桑花叶型萎缩病［!］。此病在浙江、四川、安徽、江苏、江西、广西、云南、上海、重庆等蚕区均有发生［#%*］。因此，此病被部分省（市）列为植物检疫对象，是蚕业生产上急待解决的问题。而目前对该病原尚未有定论，在收稿日期：#’’[9!#9!$基金项目：浙江省湖州市科技局项目（#’’*F,’)）作者简介：费建明（!"[#9），男，浙江湖州人，高级农艺师，农业推广硕士，从事蚕业的科研和开发。;4@?>6：?\S>@]![)8D.@!通讯作者，蒯元璋，X26：’$!!9$[![[[)；;4@?>6：UTN#’’[]P>3?8D.@生产上也没有相应的鉴定和防治技术。作者经多年的追踪调查，在病桑组织内发现类似类病毒（^>/.>R）的小分子+,-病原物，并分离获得了病桑组织类似类病毒的小分子+,-，对部分序列进行解析，并将其作为病原物的分子标志物，用于检测病株。现将有关结果报道如下。!材料与方法!8!材料桑花叶型萎缩病的材料分别采自浙江省农业科学院蚕业研究所院内桑园的病枝条作接穗（品种为桐乡青），采自浙江省湖州市和嘉兴市蚕区桑园的病叶（品种为桐乡青）。在中国农业科学院蚕业研究所无病区内，将带病接穗用袋接法嫁接健康砧木，成活后，选一株病症典型的、测定组织内确有类似类病毒小分子!"#病原物的桑树作为病桑标准株。以中国科学院微生物研究所提供的马铃薯块茎纺锤病的材料作为提取类病毒的阳性对照物。$%&桑叶总核酸提取取病叶提取总核酸，用’()*缓冲液和+,+破坏细胞中核蛋白复合体，用酚除去蛋白获得总!"#，再加氯仿去除质杂，用,-#-纤维素吸附核酸，过柱后经"./01’#-洗脱!"#，用乙醇收集、沉淀，真空干燥，放置低温冰箱内备用。$%2双向聚丙烯酰胺凝胶电泳按陈炜等的方法进行双向聚丙烯酰胺凝胶电泳［3，4］。配置35聚丙烯酰胺凝胶，第一向电泳在室温下进行，电压为&667，电泳缓冲液为$8’9-。待二甲苯蓝电泳至凝胶底部时停止电泳，弃原电泳缓冲...
