［文章编号］1000－4718(2010)05－1038－03［收稿日期］2010－01－09［修回日期］2010－03－12*［基金项目］广东省自然科学基金资助项目(No.2008B030301166;No.9151008002000002)△通讯作者Tel:020－83827812－10295;E－mail:tanning100@126.comTUNEL法原位检测心肌细胞凋亡的改进*董小莉1，谭宁1△，符永恒1，邓宇珺1，孙凯亮2(1广东省心血管病研究所，广东省人民医院，广东省医学科学院，广东广州510080;2南方医科大学，广东广州510515)［摘要］目的:脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)是检测细胞凋亡的常用方法，但以往仍有TUNEL假阳性率高的报道。本实验目的在于探讨应用TUNEL检测心肌细胞凋亡时增强其特异性的方法。方法:缺血再灌注心肌组织的石蜡切片(2μm)和冰冻切片(3μm)进行TUNEL染色。分为石蜡切片HE染色组，石蜡切片常规TUNEL组，冰冻切片改良TUNEL组。石蜡切片常规TUNEL组完全按照试剂盒说明书进行，光学显微镜下观察;冰冻切片改良TUNEL组使用荧光素(FITC)标记的dUTP及4’，6－二脒基－2－苯基吲哚(DA-PI)双重荧光染色，在共聚焦显微镜下观察。结果:TUNEL改良法凋亡背景清晰，阳性细胞主要分布在缺血再灌注损伤区域，其凋亡检出率与石蜡切片HE染色相比无显著差异(P>0.05);常规TUNEL组凋亡背景清晰度较差，非缺血再灌注损伤区域亦有大量阳性细胞出现，其凋亡率明显高于石蜡切片HE染色(P<0.01)。结论:冰冻切片改良TUNEL法可能是更适宜研究SD大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的方法。［关键词］心肌细胞凋亡;冰冻切片;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法［KEYWORDS］Cardiomyocyteapoptosis;Frozensections;TdT－mediateddUTPnicklabeling［中图分类号］R364［文献标识码］Adoi:10.3969/j.issn.1000－4718.2010.05.045心肌细胞缺血再灌注损伤造成的细胞凋亡是导致心肌损伤和心功能下降的重要原因。如何减轻心肌的缺血再灌注损伤是近年心血管临床医生及医学基础研究的重点。实验证明凋亡率的下降对减轻缺血再灌注损伤的程度及改善预后有重要作用。现已发表的文章在应用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TdT－mediateddUTPnickendlabeling，TUNEL)检测晚期凋亡时多采用石蜡切片作为组织切片方法，标记及显色过程操作步骤繁杂，费时费力，染色效果受石蜡切片制作过程及TUNEL前期切片处理过程的影响较大。已有文献报道，在进行TUNEL染色时，冰冻切片可能较石蜡切片具有更高的反应敏感性［1］。我们在研究脑利钠肽(brainnatriureticpeptide，BNP)对缺血再灌注心肌损伤的作用时，使用了包括TUNEL在内的多种方法检测凋亡的变化。在此过程中，以石蜡切片HE染色作为凋亡细胞的定位及计数标准［2，3］，我们发现使用冰冻切片进行荧光素标记的dTUP染色后用4’，6－二脒基－2－苯基吲哚(4’，6－dia-midino－2－phenylindole，DAPI)复染细胞核，激光扫描共聚焦显微镜下观察，操作简便易行，其检出的凋亡率与石蜡切片HE染色差异无显著，明显低于石蜡切片常规TUNEL检出结果。材料和方法1材料1.1动物成年雄性SD大鼠4只，购自中山大学实验动物中心，体重为(300±50)g。1.2试剂及仪器TUNEL试剂盒购于Roche，－20℃保存，使用前置于4℃溶解混合直至使用;DAPI显色试剂盒购于创为世纪公司，4℃保存;其余试剂均为国产或进口分析纯。使用仪器由广东省医学科学院提供:冰冻切片机(Leica)，石蜡切片机(Leica)，石蜡切片展片烤片机(ZMN802病理组织漂烘仪，中国)，共聚焦显微镜(Leica)。2方法2.1在体心脏心肌缺血－再灌注损伤模型制作及标本氯胺酮70mg/kg与安定7mg/kg肌肉注射麻醉后，四肢连接心电图装置，经皮尾静脉置管，肝素抗凝，连接恒速泵输液装置;胸前及颈前区备皮，颈部正中切口，钝性分离组织，游离气管后行气管切开插管，呼吸机辅助呼吸(通气量30mL/kg，频率70－80times/min);左胸骨旁切口剪开皮肤，3－4肋间钝性分离肌肉，有突破感时将自制开胸固定装置固定并撑开切口，剪断第3肋暴露左心耳及左前降支，破心包，以6－0带针丝线沿左心耳下缘穿针过线(进针深度1.5－2mm，宽2－3mm)，垫以直径3mm橡皮筋以活结结扎左前降支，以左室前壁呈紫绀或蓝紫色及...
