血清中提取IgM方法和蛋白连接方法VIP免费

血清中提取IgM方法和蛋白连接方法血清中提取IgM方法SDS-PAGE:12%TrisHClgelLane1.5μgIgM(reduced/heated)Lane2.10μgIgM(reduced/heated)Lane2.20μgIgM(reduced/heated)Lane3.5μgIgM(non-reduced/noheat)Lane4.10μgIgM(non-reduced/noheat)Lane5.20μgIgM(non-reduced/noheat)一、人IgM的基本性质总分子量970kDa，重链μ链分子量68kDa，沉降系数19S，pI=5.1-7.8，结构域5个，血液含量1.5mg/ml，半衰期10天，血清中总球蛋白比重10%，碳水化合物12%。二、盐析法盐析法（1）饱和硫酸铵溶液的配制：称（NH4）2SO4（AR）400～425克，以50～80℃之蒸馏水500ml溶解，搅拌20分钟，趁热过滤。冷却后以浓氨水（15NNH4OH）调PH至7.4。配制好的饱和硫酸铵，瓶底应有结晶析出。（2）萘氏试剂配制：称HgI11.5克，KI8克，加蒸馏水至50ml，搅拌溶解后，再加入20%NaOH50ml。（3）0.02M，PH7.4磷酸盐缓冲盐液（PhosphateBufferedSalinePBS）配制：贮存液A液：0.2MNa2HPO4：Na2HPO4·12H2O71.64克，加蒸馏水至1000ml；B液：0.2MNaH2P4：NaH2P4·2H2O3.12克，加蒸馏水至1000ml；应用液：取A液81ml加B液19ml混合，再以生理盐水作10倍稀释即成。（4）0.1M，PH7.4磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferP配制：将上述A液取81ml与B液19ml混合，再以蒸馏水对倍稀释即成。（5）20%磺基水杨酸。取xml血清加xml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%4℃，3h以上，使其充分沉淀3000rpm离心20min，弃上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml置4℃3h以上，[此时，(NH4)2SO4的饱和度为33%]。重复上述过程1~2次。末次离心所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/LpH7.4PBS溶解至xml装入透析袋对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。影响盐析的因素：影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。（3）盐的性质：最有效的盐是多电荷阴离子。（4）PH值：一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。（5）温度：盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。三、冷酒精沉淀法1.血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%保持在-5℃。产生的沉淀A含大多免疫球蛋白。2.沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/LNaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA和IgM，IgG在上清液内。3.从沉淀（B）可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀（B）悬浮在0℃水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在–2℃或-3℃低温，所得的沉淀（B-B）主要含IgA和IgM。（一）材料1．血清2．葡聚糖凝胶G2003．洗脱液0.01Mol/LpH7.4PBS（0.14Mol/LNaCl或0.1Mol/LpH8.0Tris－HCl+0.14Mol/LNaCl）。（二）操作方法选取2.50cm×90cm层析柱，用葡聚糖凝胶G200装柱，平衡后，直接加血清样品10ml或硫酸铵粗提制品，洗脱液洗脱，流速0.25ml/min，分管收集，测OD280值，第一峰即为IgM。...