生堡痘理堂苤查婴!生璺旦筮!!鲞筮兰塑g!i!』里型!!!：垒P巫!!!Q!：∑!!：!!：堕!：堡血管组织自发荧光的去除方法及应用刘春喜李大庆王荣戚立航丁士方张运血管组织尤其是动脉(如主动脉、颈总动脉、肾动脉等)具有丰富的弹性纤维与胶原纤维，后两者有很强的自发荧光，在荧光显微镜下根本不能区分特异荧光与组织自身的自发荧光，显著干扰荧光染色结果的观察，这限制了免疫荧光技术、绿色荧光蛋白(GFP)等荧光报告基因载体在心血管组织的应用⋯。我们采用滂胺天空蓝溶液以消除血管组织的自发荧光，在此基础上可检测荧光报告基因GFP的分布情况以及进行免疫荧光染色。一、材料与方法1．组织来源：8周龄APOE。一小鼠，高脂饮食6个月，左颈总动脉局部转染腺病毒载体，实验组、对照组各10只，分别转染TLR基因腺病毒(Ad—TLR)与GFP报告基因腺病毒(Ad．GFP)，转染后7d取材。4％多聚甲醛灌注固定，留取左颈总动脉、主动脉等组织，4％多聚甲醛4。C后固定过夜，冷冻切片，片厚6¨m。2．去除血管的自发荧光：组织切片经蒸馏水湿润，置于0．5％滂胺天空蓝(ChicagoSkyBlue6B，Sigma公司)浸泡10min，PBS洗5min，荧光显微镜下观察自发荧光的存在情况。对于Ad—GFP局部转染组的颈总动脉切片，先去除切片的自发荧光，然后在荧光显微镜下观察GFP的分布与荧光强度。3．免疫荧光染色：去除自发荧光的冷冻切片，PBS洗，3min，5％正常羊血清封闭20min；鼠抗0【．actin单克隆抗体(Sigma公司，稀释度1：lOOO)40c过夜；PBS洗，5minX3次；FITC标记的驴抗鼠二抗(Jacson公司，稀释度1：50)37℃，30min，PBS洗，5rain×3次；DAPI对比染细胞核，PBS洗，5min×3次；抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察。二、结果未经处理的组织切片在荧光显微镜下观察，其自发蓝色、绿色、红色荧光均明显可见，经滂胺天空蓝处理后，其自发绿色荧光完全消除(图1)。对于Ad．GFP局部转染的血管组织，去除其自发绿色荧光后，GFP本身的绿色荧光清晰可见(图2)。去除自发绿色荧光后的血管切片，采用免疫荧光技术检测平滑肌仅一actin的表达情况，可见亮绿荧光分布，与血管的红色荧光形成鲜明的对比(图3)。三、讨论自发荧光是指物质未经荧光色素染色，在紫外光或短波作者单位：250012济南，山东大学齐鲁医院教育部和卫生部心血管重构和功能研究重点实验室通信作者：刘春喜(E—mail：liuchunxi一1999@163．com)．技术交流．图1去除自发荧光前后血管的图像，A、B、C分别是未经处理血管的蓝色、绿色、红色荧光；D、E、F分别是经滂胺天空蓝处理后的血管蓝色、绿色、红色荧光图像标尺为100}rm图2Ad—GFP局部转染的血管绿色荧光图像，A：未经处理的血管；B：经滂胺天空蓝处理后的血管标尺为100¨m照射下呈现的荧光。除结缔组织外，自发荧光一般较弱。动物组织中的胶原纤维、弹性纤维有较强的自发荧光，具有很宽的发射光谱，实验室所用荧光显微镜多为宽带滤光片，不能滤掉组织的自发荧光，因此只能采用化学方法除去组织的自发荧光。滂胺天空蓝可以有效消除切片中的自发绿色荧光，而组织的GFP绿色荧光不受影响，通过观察GFP的分布与荧光强度，间接体现载体所带目的基因的表达情况。去除自发荧光后的含有GFP的切片还可以使用非荧光标记的二抗进行万方数据空堡疸堡堂苤查!螋!生兰旦筮!!鲞筮兰翅鱼!也』旦型!!!：垒P巫!!螋!：!!!：!!：盟!：堡图3血管d—actin免疫荧光染色，A：DAPI对比染细胞核；B：a—actin的图像，绿色荧光代表平滑肌细胞；C：血管的红色荧光；D：A、B、C的叠加图像标尺为lo岬免疫组织化学染色，以检测某抗原的分布情况。另外，用滂胺天空蓝处理切片后，血管的弹性纤维被染成蓝色，可作为免疫组织化学染色的衬染，清晰地显示血管的轮廓。组织切片经滂胺天空蓝处理后，背景组织细胞呈现很强的红色荧光，所以处理后的切片不宜用红色荧光标记的抗·277·体，但可以用绿色荧光(如FITC)标记的抗体进行免疫荧光染色，利用组织的红色荧光作对比染色，使得图像对比更加鲜明。另有文献报道，用激光共聚焦显微镜采集图像，采用Qdot双共轭与双光子激发扫描的技术可以避免血管切片的自发荧光与多重荧光标记的串扰现象旧J，使用这种技术不用提前去除血管的...
