北京大学医学部病原生物学系版权所有(2009)1实验二细菌分离培养相关技术及应用（BacterialIsolationandCulture：SomeTechniquesandApplications）一、无菌操作技术（Aseptictechnique）【实验目的】认识无菌操作的重要意义，学习基本的无菌操作方法。【实验原理】（一）无论在研究实验室、临床实验室还是教学实验室，保证实验用或检测用微生物材料不被其他微生物污染是非常重要的；此外，保证实验人员不被这些微生物感染也非常重要。因此，在接种细菌时，要求所用物品如培养基、玻璃器皿和器械等必须灭菌；空间应进行紫外线消毒；操作者应穿隔离衣，必要时应带口罩、帽子和医用手套。除此之外，对接种操作技术本身也要求做到防止污染和感染的发生，这种防止污染和感染发生的接种技术称为无菌操作技术。（二）培养细菌常用的接种工具有接种环、接种针、涂布棒、吸管和酒精灯。1.接种工具：接种环（针）是由白金丝或镍合金丝制成。接种环是在金属丝前端卷成一直径2mm~3mm小环又称白金耳。用于细菌分离接种或纯培养接种。接种针多用于半固体培养基穿刺接种。涂布棒一般为前端成三角形的玻璃小棒，用于细菌在固体培养基上进行大面积均匀涂布。吸管可用于菌液的大量和定量接种。2.无菌操作技术（见图1‐2‐1）：用接种环（针）取菌时，先将接种环以45度角插入酒精灯火焰的内焰（黄色火苗处，温度最低，防止过热造成的崩溅）处烧灼片刻，再移至外焰（蓝色火苗处，温度最高）烧灼片刻，之后将接种环横过来水平移动，烧灼全部镍铬丝部分。以无菌操作手法打开培养物，将烧灼灭菌的接种环（针）在琼脂表面或试管壁上冷却6~8秒，取少许菌苔或菌液，同样以无菌操作的手法接种至新鲜培养基内（单菌落划线分离或集接种等）。取菌时如果接种环过热，接触菌液或菌苔时易产生感染性气溶胶，引起自身感染或污染环境，也会杀死菌种。接种应在火焰附近进行，蘸有细菌的接种环（针）不能碰触衣物和操作台等其它物品。接种结束要立即将染菌金属丝用火焰灭菌，并将接种柄置于接种架上（不得随手乱放）。用吸管接种时，吸管吸取的菌液在离开标本管液面时，吸管尖端应存有一段空气，以防止在吸管移动时菌液滴在台面上。用涂布棒或吸管接种时，接种完毕的器具应放于消毒液中。所有无菌操作完毕，应将带有细菌物品妥善处理，并将其空间进行紫外线消毒。图1‐2‐1.无菌操作技术示意图。【实验材料】（一）试剂：LB琼脂培养基。（二）器械（仪器）：接种环、酒精灯、恒温培养箱。北京大学医学部病原生物学系版权所有(2009)2（三）菌种：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）菌液。【实验步骤】（一）按无菌操作手法，用接种环从大肠埃希氏菌菌液中取一环细菌。（二）用无菌操作手法，将接种环上的细菌接种到LB琼脂培养基上。（三）将接好种的培养皿倒置放在37℃恒温培养箱中，培养24h。（四）从培养箱中取出培养皿，观察其上细菌生长情况，从菌苔（落）特点判断是否有杂菌污染，以判断无菌操作是否合格。【注意事项】（一）热的接种环应在培养基无菌生长区稍加降温后，再刮取细菌。否则易损伤细菌且易产生微生物气溶胶引起感染。（二）细菌培养时，培养皿应底部朝上倒置放在培养箱中。因为皿盖朝上正向放置时，37℃条件下培养基中水分挥发可凝集在皿盖上，形成液滴，液滴滴落在琼脂表面，易引起培养物污染或单菌落连接在一起成片生长。二、细菌的分离和纯培养法（Methodsofbacterialisolationandpureculture）【实验目的】了解细菌分离和纯培养的常用方法，掌握用三划线法分离获得单菌落的操作技术。【实验原理】细菌分离培养法也叫细菌分离接种技术，即应用接种环将细菌在固体培养基平板上划线（streakplatetechnique）接种，将混杂细菌逐一分散成单个，经培养后各自形成单个菌落，将单个菌落移种增殖后可得到纯种细菌。图1‐2‐2中介绍了几种划线分离方法，其目的都是把细菌分散越开越好。但应注意每划完一个区域，都要将接种环灭菌后再从菌稀的地方划另外部分。图1‐2‐2.在培养基平板上划线分离细菌的不同划线接种法示意图。选择图中a~d哪种划线接种模式，取决于样品中微生物浓度的情况。微生物浓度越高，划线次...
